栝樓性別的分子標(biāo)記研究.pdf

1、　　1.為了從富含多糖和多酚等次生代謝物質(zhì)的栝樓葉片中分離出高質(zhì)量的基因組DNA，以栝樓葉片為材料，對(duì)4種不同的DNA提取方法(CTAB常規(guī)法、CTAB區(qū)室法、SDS常規(guī)法、高鹽低pH法)進(jìn)行了試驗(yàn)研究，并首次采用CTAB區(qū)室法提取栝樓基因組DNA。結(jié)果表明，CTAB區(qū)室法所提取的DNA效果較好，其OD260/OD280值為1.8以上，1.5﹪瓊脂糖凝膠電泳譜帶明亮清晰，而且可以獲得多態(tài)性好的PCR擴(kuò)增圖譜?！　?.采用L16(45)

2、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，快速、有效地確定了適合栝樓的最佳擴(kuò)增條件(包括基因組DNA、dNTP、引物、Mg2+、TaqDNA聚合酶等濃度的最佳組合)。結(jié)果表明：反應(yīng)體系中，模板DNA的適宜濃度為1ng/μL，dNTP的適宜濃度為0.2mM，primer的適宜濃度為0.04μM，Mg2+的適宜濃度為2.0mM，Taq聚合酶的用量為1.0U。PCR的適宜程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，37℃復(fù)性40s，72℃延伸1.5min，36個(gè)循環(huán)

3、；72℃延伸10min?！　?.本實(shí)驗(yàn)通過RAPD技術(shù)獲得與栝樓性別連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)一步為栝樓早期性別鑒定提供研究基礎(chǔ)。通過葉片總DNA抽提、RAPD標(biāo)記分析及反復(fù)的試驗(yàn)篩選，找到了一個(gè)適用于栝樓的RAPD反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)。在80個(gè)隨機(jī)引物中，用引物AN18擴(kuò)增得到一條約0.6kb的雄性多態(tài)性片段(TKM647)。對(duì)該片段進(jìn)行了克隆與序列分析，但轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記時(shí)雌性植株產(chǎn)生了條帶，表明為假陽性標(biāo)記。此研究是對(duì)雌雄異株藥材栝樓在