蘆筍花藥培養(yǎng)與再生植株性別分子標(biāo)記鑒定.pdf

1、蘆筍(Asparagusofficinalis.Linn)學(xué)名石刁柏,以嫩莖供食,具有極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值,有防癌、抗癌,預(yù)防和治療高血壓、心臟病等功效,是國(guó)際公認(rèn)的抗癌食品,享有“蔬菜之王”的美譽(yù)。我國(guó)雖已成為世界蘆筍生產(chǎn)與出口的大國(guó),但我國(guó)蘆筍生產(chǎn)用種主要依靠進(jìn)口,缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種成為制約我國(guó)蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。蘆筍是雌雄異株植物,性別由一對(duì)等位基因控制,雄性基因型為Mm,雌性基因型為mm,基因型為MM的雄株為超雄株。雄株具

2、有生長(zhǎng)旺盛、品質(zhì)好、產(chǎn)量高、壽命長(zhǎng)、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn),因此培育全雄品種成為國(guó)內(nèi)外蘆筍育種的主要方向,而培育全雄品種的關(guān)鍵是獲得超雄株(MM)?；ㄋ幣囵B(yǎng)是獲得超雄株的簡(jiǎn)單且有效的途徑。本試驗(yàn)以當(dāng)前生產(chǎn)中表現(xiàn)較好的4個(gè)優(yōu)良品種為試材,研究了季節(jié)、預(yù)處理、NAA及6-BA等因子,對(duì)蘆筍花藥培養(yǎng)形成愈傷組織的影響,建立了‘阿波羅’、‘冠軍’以及‘NJ987’三個(gè)優(yōu)良品種的花藥培養(yǎng)技術(shù)體系,并利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)再生植株進(jìn)行了性別鑒定。主要研究結(jié)果如

3、下:
　　 1.蘆筍花藥培養(yǎng)愈傷組織的誘導(dǎo):
　　 (1)季節(jié)影響蘆筍花藥愈傷組織的誘導(dǎo),每年5月份采集的花藥均能誘導(dǎo)形成愈傷組織,而7月與9月采集的花藥未能誘導(dǎo)出愈傷組織。
　　 (2)當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為1-2mm時(shí),花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高;花蕾長(zhǎng)度為2-3mm、3-4mm時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率降低;花蕾長(zhǎng)度為4mm以上時(shí),未能誘導(dǎo)出愈傷組織。
　　 (3)不同品種對(duì)低溫預(yù)處理的要求不同,在4℃低溫下,‘阿波羅’

4、、‘冠軍’和‘NJ987’花藥處理5d,愈傷組織誘導(dǎo)率最高;而‘格蘭蒂’花藥處理3d,愈傷組織誘導(dǎo)率最高。
　　 (4)蘆筍花藥愈傷組織誘導(dǎo)形成的條件存在基因型差異,‘阿波羅’、‘冠軍’和‘NJ987’在MS+2.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA條件下愈傷組織誘導(dǎo)率最高,且能自然分化成芽;而‘格蘭蒂’在MS+2.0mg/L6-BA+1.25mg/LNAA,愈傷組織誘導(dǎo)率最高,但未分化成芽,對(duì)其愈傷組織進(jìn)行再分化處理,未得

5、到再生植株。
　　 2.‘阿波羅’、‘冠軍’和‘NJ987’的再生植株最適繼代增殖條件為:MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。
　　 3.蘆筍花藥培養(yǎng)再生植株染色體倍性呈多樣性。本試驗(yàn)對(duì)142株‘阿波羅’和341株‘NJ987’進(jìn)行倍性鑒定,其中‘阿波羅’再生植株染色體數(shù)目為單倍體的占4.93％,二倍體占30.99%,三倍體占24.65%,四倍體占15.49%,非整倍體占23.94%;而‘NJ987’的再

6、生植株染色體數(shù)目為單倍體的占2.64%,二倍體占78.89%,三倍體占7.04%,四倍體占4.99%,非整倍體占6.45%。
　　 4.蘆筍再生植株性別的鑒定:
　　 (1)本試驗(yàn)優(yōu)化了鑒定蘆筍性別的STS標(biāo)記體系,最佳PCR體系為20μL:總DNA提取液3μL,10×PCRBuffer(MgCl2)2μL,dNTP(2.5mM)0.8μL,TaqDNA酶(5U/μL)0.24μL,Asp1-T7-Pc(10U/μL)0

7、.2μL,Asp1-T7-Ph(10U/μL)0.2μL,MgCl2(25mM)0.4μL,ddH2O13.16μL;反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性30s;94℃變性30s,47℃退火30s,72℃延伸40s,32個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存。
　　 (2)本試驗(yàn)利用Aspl-T7標(biāo)記對(duì)蘆筍花藥培養(yǎng)產(chǎn)生的370個(gè)再生單株進(jìn)行了檢測(cè),其中251株在440bp附近擴(kuò)增出特異片段,可確定為雄性株(MM、Mm、M)。其中‘阿波羅’品