蛇皮果性別相關(guān)分子標(biāo)記的研究.pdf

1、蛇皮果（Salaccazalacca(Gaertner) Voss ex. Vilm.）為棕櫚科（Palmae）蛇皮果屬（Salacca）果樹，原產(chǎn)于馬來半島至爪哇一帶，引進(jìn)我國(guó)已有20多年歷史。有性繁殖是蛇皮果繁殖的重要方式，然而有性繁殖的蛇皮果苗木難以從形態(tài)上區(qū)分其性別，用實(shí)生苗造林時(shí)無法對(duì)雌雄比例進(jìn)行合理配置。有鑒于此，本文通過RAPD分子標(biāo)記技術(shù)找出了與蛇皮果性別相關(guān)的雄性特異性片段并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)了蛇皮果的早期性

2、別鑒定。研究結(jié)果不僅可用于鑒別蛇皮果實(shí)生苗的性別，還可與種胚組培技術(shù)相結(jié)合形成蛇皮果雌苗快繁技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)按需提供雌雄苗木提供技術(shù)支撐，改變現(xiàn)有雌雄混雜造林帶來的局限。因此，本研究對(duì)于提高我國(guó)蛇皮果栽培水平具有重要意義。
　　1、以蛇皮果新鮮葉片為材料，測(cè)試CTAB法、SDS法、CTAB-free法和改良CTAB法等4種蛇皮果基因組DNA提取方法，結(jié)果表明：改良CTAB法能有效地去除酚類物質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)的干擾，是蛇皮果基因組D

3、NA的有效提取方法。
　　2、以上述提取方法提取的蛇皮果基因組DNA為材料，通過調(diào)節(jié)Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶濃度以及退火溫度觀測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的電泳效果，結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增體系為15μL：10×buffer1.5μL，0.12mmol/L dNTPs，0.12U/μLTaqDNA聚合酶，1.4mmol/L Mg2+，1.0μmol/L RAPD引物，12ng DNA模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min

4、；再40個(gè)循環(huán)：94℃變性30s，39℃退火30s和72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。
　　3、利用上述1和2確定的方法，以蛇皮果‘Pondoh’品種雌雄株各10株為材料，篩選了900條隨機(jī)引物，結(jié)果表明：只有引物S1431（序列：5’-CCTGGGTCAG-3’）產(chǎn)生了一條大小約為1600bp的雄性特異片段。利用S1431引物對(duì)同一蛇皮果林另外隨機(jī)抽取的蛇皮果雌雄株各10株進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果相同，說明RAPD分子標(biāo)記

5、具有鑒別蛇皮果性別的可行性。
　　4、對(duì)蛇皮果RAPD分子標(biāo)記獲得的雄性特異片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，結(jié)果表明：該特異性片段為一條1640bp堿基的序列，具體序列省略。
　　5、根據(jù)測(cè)序所得的序列結(jié)果進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)出一對(duì)大小為18bp的SCAR標(biāo)記引物 LF（5’-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3’）和引物 LR（5’-TGACACCTCCTCCCATAT-3’），利用該對(duì)引物對(duì)12株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期蛇皮果成年植株進(jìn)行PCR反應(yīng)

6、，結(jié)合繁殖生長(zhǎng)期觀察，結(jié)果表明：有雄性特異片段的為雄株，沒有雄性特異片段的為雌株。同時(shí)利用該對(duì)引物對(duì)20株蛇皮果實(shí)生苗進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果表明：其中有8個(gè)樣本得到與雄株相同大小的特異片段，另外12個(gè)樣本沒有任何片段。利用該對(duì)引物對(duì)7株‘Gading Auy’品種、4株‘Pondoh’品種和1株‘Bali’品種共12株蛇皮果種胚組培苗進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果沒有得到任何特異性片段。
　　6、以種子數(shù)不同的果實(shí)育出的苗為材料，利用上述L

7、F和LR引物進(jìn)行分析，根據(jù)雄性特異片段的有無確定實(shí)生苗的雌雄，結(jié)果表明：一個(gè)果內(nèi)具有2個(gè)種子和3個(gè)種子繁育出的群體雌雄比例為1:1；一個(gè)果內(nèi)具有1個(gè)種子的雄性概率為80％；蛇皮果實(shí)生苗的總體雌雄比例為1:1。
　　7、對(duì)含雄性特異片段的蛇皮果和不含雄性特異片段的蛇皮果的種子重量、苗木葉總長(zhǎng)度和根總長(zhǎng)度進(jìn)行比較，結(jié)果表明：兩組各性狀之間不存在顯著差異，表明難于通過這些性狀鑒別實(shí)生苗性別。
　　8、對(duì)蛇皮果雌雄株早期性別鑒定基因