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1、ABC1(for Activity of bcl complex)類蛋白激酶是近年來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)的一類新的非典型性激酶。自被發(fā)現(xiàn)之始,就漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn),但植物中該激酶的研究較少,對(duì)于其在植物中的功能更相知甚少。本實(shí)驗(yàn)室在擬南芥中克隆到一個(gè)編碼ABC1類蛋白激酶的基因,AtACDO1(ABC1-like Kinase related to Chlorophyll Degradation and Oxidative stress),在
2、對(duì)擬南芥和水稻ABC1基因家族成員進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式的整體研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)擬南芥AtACDO1基因的功能進(jìn)行了深入研究,著重探討該基因在葉綠素代謝以及抗氧化脅迫方面的作用,并探究了其可能的作用機(jī)理。主要取得了以下結(jié)果:
1、擬南芥和水稻ABC1類蛋白激酶家族生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在擬南芥中該家族有17個(gè)成員(AtABC1P1-AtABC1P17);水稻種有15個(gè)成員(OsABC1P1-OsABC1P15)。該
3、家族所有成員在蛋白質(zhì)序列上含有一個(gè)典型的ABC1結(jié)構(gòu)域,并且具有激酶保守的VAVK-like和DFG-like催化基序。所有32個(gè)成員在進(jìn)化上可分為3個(gè)亞家族,同時(shí)發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥成員間的進(jìn)化關(guān)系較各自物種本身成員之間更近。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該家族成員大多定位于葉綠體或線粒體。
2.利用RT-PCR分析了擬南芥和水稻中該家族成員在不同脅迫條件下的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在高光下AtABC1P2、AtABC1P5、AtABC
4、1P17、OsABC1P7、和OsABC1P8表達(dá)水平上調(diào);而除了AtABC1P2外,幾乎所有AtABC1Ps均在高溫處理時(shí)表達(dá)水平下降。AtABC1P15和OsABC1P8表達(dá)受ABA誘導(dǎo),而AtABC1P17、OsABC1P1、OsABC1P2以及OsABC1P13的表達(dá)水平被ABA下調(diào)。大部分AtABC1Ps受CdCl2短時(shí)誘導(dǎo);而大部分OsABC1Ps在NaCl處理時(shí),表達(dá)下調(diào)。同時(shí),大部分AtABC1Ps受SA誘導(dǎo),而OsAB
5、C1Ps則對(duì)SA沒有響應(yīng)。
3、RT-PCR檢測(cè)了AtACDO1基因在擬南芥不同組織和器官中表達(dá)水平。結(jié)果表明該基因在擬南芥的根、莖、葉、花、角果等組織中均有表達(dá),且葉片中表達(dá)最強(qiáng)。這與利用AtACDO1基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的研究結(jié)果相一致。AtACDO1-GFP轉(zhuǎn)化植物后提取原生質(zhì)體,用共聚焦激光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)AtACDO1定位于葉綠體。
4、表型分析發(fā)現(xiàn),擬南芥AtACDO1敲減轉(zhuǎn)基因植株(At
6、ACDO1 RNAi)在正常培養(yǎng)條件下葉片泛黃,且葉片長(zhǎng)度、寬度以及葉面積變小,但是單位面積葉片鮮重不變。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),AtACDO1 RNAi株系中葉綠素和類胡蘿卜素(新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素和β-胡蘿卜素)含量顯著低于野生型,且兩種色素者呈一定比例減少,但透射電鏡觀察葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)其在AtACDO1 RNAi株系與野生型有差異。NB-PAGE和蔗糖梯度離心分析光系統(tǒng)復(fù)合物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AtACDO1 RNAi株系與野生
7、型中二者亦無(wú)明顯差異。
5、不同的生長(zhǎng)時(shí)期(10、20或30 d)、不同光強(qiáng)(10、40、80或120 μmolm-2s-1)以及不同光質(zhì)(白光、藍(lán)光、紅光以及遠(yuǎn)紅光)條件下,AtACDO1 RNAi植株中葉綠素含量均顯著低于野生型;且在生長(zhǎng)第10 d、和20 d以及紅光下差異最為明顯。在黑暗誘導(dǎo)的衰老過(guò)程中,AtACDO1 RNAi植株中葉綠素含量顯著低于野生型,但AtACDO1敲減轉(zhuǎn)基因植株中葉綠素降解速度較野生型慢。
8、
6、在不同光強(qiáng)下培養(yǎng)的擬南芥,AtACDO1 RNAi植株中類胡蘿卜素含量在光強(qiáng)為10 μmolm-1s-1時(shí)高于野生型,在其他光強(qiáng)下均低于野生型。
7、AtACDO1 RNAi株系幼苗在去黃化過(guò)程中葉綠素的合成速度與野生型中無(wú)明顯差異,且在正常生長(zhǎng)的植株葉片中葉綠素合成前體Pchlide與野生型間無(wú)差異
8、AtACDO1 RNAi株系中,編碼葉綠素代謝酶的基因,包括HEMC、CHLH、CH
9、LD、DVR、PORA、PORB、PORC、CAO、LH1、CLH2、ACD1和ACD2以及類胡蘿卜素代謝基因ZDS和PDS在不同生長(zhǎng)時(shí)期以及不同光強(qiáng)下的表達(dá)與野生型之間均不存在差異,但AtACDO1 RNAi株系中葉綠素酶活性顯著高于野生型,且積累降解產(chǎn)物Chlide和Pheide。
9、在正常培養(yǎng)條件下AtACDO1 RNAi植株光合放氧速率顯著低于野生型,但光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)效率
10、ФPSⅡ、非光化學(xué)淬滅(NPQ)以及電子傳遞速率(ETR)與野生型之間沒有差異。在高光脅迫下FV/Fm低于卻低于野生型,但光系統(tǒng)Ⅱ恢復(fù)略快。
10、非生物脅迫處理發(fā)現(xiàn),在NaCl(120 mM)、甘露醇(300 mM)以及葡萄糖(300 mM)處理下,AtACDO1 RNAi株系萌發(fā)率與野生型之間沒有差異。在120 mM NaCl、120 mM KCl、100 mM KNO3、100 mMNaNO3以及15 μM CdCl
11、2條件下培養(yǎng)的AMCDO1 RNAi、Co1-0和35S::AMCDO1株系幼苗中葉綠素含量均較正常條件下降低,尤以NaCl和KCl培養(yǎng)條件下最甚。氧化脅迫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),正常條件培養(yǎng)20d左右植株的葉片卻對(duì)氧化脅迫敏感,體內(nèi)積累更多H2O2;在連續(xù)高光(300 μmolm-2s-1)下培養(yǎng)7d的AtACDO1 RNAi植株葉片壞死情況較野生型嚴(yán)重,其葉片中花色素苷顯著低于野生型;且AtACDO1受MV誘導(dǎo);敲減植株葉片對(duì)MV敏感,CSD1,
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