泛PI3K抑制劑BKM120聯(lián)合PARP抑制劑Olaparib靶向治療卵巢癌的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌在婦科腫瘤中的發(fā)病率位居第三位，死亡率位居首位。原發(fā)性卵巢癌發(fā)病隱匿，早期診斷困難，80％患者就診時(shí)已為晚期，盡管經(jīng)過(guò)手術(shù)和化療可達(dá)到完全緩解，但多數(shù)晚期患者仍會(huì)在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，最終衍變?yōu)榛熌退幎劳?。其總體5年生存率在僅30%左右。因此尋找高效低毒的分子靶向藥物，提高卵巢癌治療療效，降低卵巢癌死亡率是亟待解決的重大問(wèn)題。
　　PI3K通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖和生存能力等重要細(xì)胞功能的信號(hào)通路。在體內(nèi)和體外研究表明，一些 P

2、I3K抑制劑在卵巢癌中無(wú)論是作為單藥還是和細(xì)胞毒性抗癌試劑聯(lián)合使用均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。BKM120是一種泛 PI3K抑制劑，在I/II期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，BKM120對(duì)PI3K通路正?；虍惓＜せ畹母鞣N腫瘤具有抗腫瘤的治療效應(yīng)。在細(xì)胞系和腫瘤異種移植模型中也顯示出抗增殖，促凋亡的活性。另外，抑制PI3K通路影響DNA雙鏈損傷修復(fù)的同源重組過(guò)程。
　　多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制劑是被 FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)作為治療B

3、RCA突變的晚期卵巢癌靶向治療藥物。PARP是 DNA單鏈斷裂（SSB）修復(fù)的關(guān)鍵分子之一，參與基因組的完整性的監(jiān)控和修復(fù)。BRCA蛋白是 DNA雙鏈斷裂（DSB）后進(jìn)行同源重組（HR）過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白。BRCA1通過(guò)介導(dǎo) HR修復(fù)過(guò)程具抑癌活性。BRCA基因缺陷的細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì) PARP抑制高度敏感性，引起基因組不穩(wěn)定和細(xì)胞凋亡。PARP抑制劑Olaparib和PI3K抑制劑BKM120聯(lián)合應(yīng)用對(duì) BRCA1基因缺陷或正常的乳腺癌及 P

4、TEN和 P53缺陷的激素不敏感型前列腺癌具有協(xié)同抗癌作用。有關(guān)BKM120和Olaparib聯(lián)合應(yīng)用治療卵巢癌療效及其作用機(jī)制并不十分清楚，本研究，將探討該聯(lián)合治療方案在體外和體內(nèi)治療卵巢癌的潛在機(jī)制，明確該聯(lián)合治療方案的適用人群。
　　目的：
　　多種信號(hào)通路的異常激活影響著卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，其中PI3K信號(hào)通路40%卵巢癌病例中有異常改變。PI3K和PARP抑制聯(lián)合治療方案已以臨床前實(shí)驗(yàn)被證明在BRCA基因表達(dá)正常的乳

5、腺癌和前列腺癌有較好療效。然而，關(guān)于該聯(lián)合治療方案對(duì)于卵巢癌的療效是有限的。本研究分別對(duì)同時(shí)抑制PI3K通路和PARP對(duì)PIK3CA突變的卵巢癌細(xì)胞和PIK3CA野生型卵巢癌的抗癌的療效和機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法：
　　用PI3K抑制劑BKM120和PARP抑制劑Olaparib單獨(dú)或聯(lián)合處理11種卵巢癌細(xì)胞系，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制效率，分析攜帶不同基因特點(diǎn)的卵巢癌細(xì)胞之間存在的差異。
　?。?）選擇

6、攜帶PIK3CA突變的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、HEYA8、IGROV1和EFO27細(xì)胞系；采用CCK-8分析方法估算BKM120和Olaparib單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)這4種卵巢癌細(xì)胞活性影響；利用彗星實(shí)驗(yàn)、免疫熒光和免疫印跡法（Western Blot）實(shí)驗(yàn)觀察BKM120和Olaparib單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)4種卵巢癌細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)過(guò)程的影響；利用流式細(xì)胞術(shù)觀察這種治療方案對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；Western Blot技術(shù)探討這種治療方案對(duì)

7、PI3K/AKT/mTOR通路及凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)量影響；利用劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察這種治療方案對(duì)卵巢癌的細(xì)胞遷移和侵襲生物活性的影響；利用real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BRCA1/2表達(dá)情況；將用Luciferase標(biāo)記的SKOV3細(xì)胞行腹腔注射制備卵巢癌腹腔播散模型，在此模型的基礎(chǔ)上用BKM120和Olaparib單獨(dú)或聯(lián)合治療，用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察PI3K/AKT/mTOR通路、凋亡的相關(guān)及BRCA1等蛋白表達(dá)情

8、況。
　　（2）用BKM120和/或PARP抑制劑Olaparib處理3種攜帶野生型PIK3CA基因的卵巢癌細(xì)胞株，用CCK8方法、免疫印跡法，彗星試驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光技術(shù)對(duì)觀察藥物對(duì)細(xì)胞活性、增殖和DNA損傷修復(fù)的影響。用聯(lián)合指數(shù)（combination index,CI）分析BKM120和Olaparib對(duì)卵巢癌細(xì)胞的協(xié)同抑制作用。建立人類卵巢癌組織體外培養(yǎng)模型，給予BKM120和/或PARP抑制劑Olaparib處理后

9、，用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察PI3K/AKT/mTOR通路、凋亡的相關(guān)及 BRCA1等蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　我們結(jié)合文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)有關(guān)這11種卵巢癌細(xì)胞的全基因組測(cè)序結(jié)果，選定與 PI3K信號(hào)通路相關(guān)的基因（即K-ras、p53、PIK3CA、PTEN和 EGFR等）進(jìn)行分析，結(jié)果提示不能確定某一個(gè)單一突變基因與腫瘤細(xì)胞對(duì) BKM120治療反應(yīng)之間具有明顯的關(guān)聯(lián)性。因些，我們分別選擇 PIK3CA突變和野生型卵巢癌細(xì)胞系

10、做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　?。?）PI3K抑制劑BKM120有效抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，BKM120可導(dǎo)致γH2AX增加，使同源重組修復(fù)蛋白R(shí)AD51表達(dá)量降。聯(lián)合抑制PI3K和PARP的有效協(xié)同抑制攜帶PIK3CA突變卵巢癌細(xì)胞（包括SKOV3、HEYA8和IGROV1）的增殖、存活和遷移。與PARP或PI3K抑制劑單獨(dú)處理相比，聯(lián)合用藥處理可引起更強(qiáng)的DNA損傷反應(yīng)、更大幅度降低PI3K/mTOR信號(hào)及ERK的磷酸化水平升高。值得注意的是

11、，對(duì)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行PI3K和PARP同時(shí)抑制可以顯著降低BRCA1/2表達(dá)。此外，該聯(lián)合治療方案的效果在腹腔內(nèi)播散移植瘤小鼠模型中被證實(shí)，抑制PI3K/AKT信號(hào)使SKOV3卵巢癌細(xì)胞BRCA1的表達(dá)顯著降低，減少腫瘤負(fù)荷。BKM120聯(lián)合Olaparib處理 EFO27細(xì)胞并沒(méi)有得到相同結(jié)果。與其他三種卵巢癌細(xì)胞相比，EFO27細(xì)胞對(duì)BKM120和Olaparib聯(lián)合治療方案表現(xiàn)耐藥。
　?。?）聯(lián)合抑制PI3K通路和PARP可

12、有效協(xié)同抑制PIK3CA野生型卵巢癌細(xì)胞株（OVCA433，OVCAR5，和OVCAR8）的增殖。BKM120聯(lián)合Olaparib誘導(dǎo)PIK3CA野生型卵巢癌細(xì)胞凋亡。BKM120聯(lián)合Olaparib誘導(dǎo)PIK3CA野生型卵巢癌細(xì)胞的 pS6RP大副度降低和增強(qiáng)DNA損傷反應(yīng)。值得注意的是，雙重抑制 PI3K通路和 PARP可使這些卵巢癌細(xì)胞的BRCA1/2表達(dá)顯著降低。此外，對(duì)人類卵巢癌的移植體體外培養(yǎng)，暴露BKM120和Olapar

13、ib后可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，并伴隨BRCA1表達(dá)降低。
　　結(jié)論：
　　（1）聯(lián)合抑制PI3K通路和PARP是治療PIK3CA突變卵巢癌有效方案；同時(shí)，PI3K抑制劑使BRCA下調(diào)可以作為評(píng)估聯(lián)合使用PARP抑制是否會(huì)有效的生物標(biāo)記物。
　?。?）聯(lián)合抑制PI3K通路和PARP可有效治療PIK3CA野生型卵巢癌，而不依賴于BRCA1/2基因狀態(tài)。提示，BKM120聯(lián)合Olaparib應(yīng)用可有效治療的卵