PI3K抑制劑LY294002誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細胞凋亡機制的研究.pdf

1、目的:PI3K可以促進細胞的生長、增殖、分裂和遷移，其異常高表達是卵巢癌進展中的重要事件。我們在前次實驗中觀察到，PI3K抑制劑LY294002可以引起卵巢癌SKOV-3細胞凋亡增加;同時發(fā)現(xiàn)Akt及下游凋亡抑制蛋白(XIAP和cIAP2)的表達也出現(xiàn)下調(diào)，這提示LY294002的促凋亡效應(yīng)可能與Akt的活性被抑制有關(guān)，但其引起凋亡啟動的具體機制尚不清楚。本實驗使用Annexin V-FITC/PI雙染色法和熒光底物法，分別檢測LY29

2、4002作用SKOV-3時的凋亡率變化及凋亡蛋白酶活性，探討PI3K-Akt信號通路促進凋亡的作用機制，為PI3K小分子抑制劑應(yīng)用于卵巢癌臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:本實驗以人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞系SKOV-3為研究對象，首先在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)卵巢癌細胞，選擇其中匯合度達到70％左右，且生長良好的細胞進行以下實驗。(1)使用Annexin V-FITC/PI雙染色法通過流式細胞儀檢測LY294002以不

3、同濃度(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)作用不同時間(24h、48h、72h、96h)后細胞的凋亡率。(2)將正常貼壁生長的SKOV-3細胞隨機分為對照組和藥物組，藥物組加入適量LY294002使其終濃度達到40μM;于48h使用熒光底物法通過熒光分光光度計分別檢測對照組和藥物組細胞中Caspase-3，Caspase-9，Caspase-8的活性。(3)所得數(shù)據(jù)以(x)±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較

4、采用配對樣本t檢驗，p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計運算使用SPSS17.0。
　　 結(jié)果:(1)不同濃度LY294002(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)作用不同時間(24h、48h、72h、96h)后的細胞凋亡率(％):24小時，1.54、2.20、2.48、3.37、5.13;48小時，2.35、6.51、7.28、9.62、10.49;72小時，2.98，6.78，7.73，9.22，12.14;96小時，3

5、.64，7.23，8.21，11.57，15.43。相同濃度LY294002各時間組間比較，凋亡率隨時間延長而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);但相同孵育時間各濃度組間比較，凋亡率表現(xiàn)不一致，當(dāng)以低濃度（5μM、10μM）LY294002孵育24小時，凋亡率無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);當(dāng)孵育時間超過24小時(48h、72h、96h)，細胞凋亡率隨濃度的提高而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。(2)LY294

6、002(40μM，48h)作用后caspase-3活性:對照組為245.22，藥物組為484.78，藥物組熒光強度值高于對照組(p＜0.05)，即LY294002作用下SKOV-3細胞中caspase-3的活性高于對照組。(3) LY294002(40μM，48h)作用后caspase-9活性:對照組為190.25，藥物組為255.50，藥物組熒光強度值高于對照組(p＜0.05)，即LY294002作用下SKOV-3細胞中caspase

7、-9的活性高于對照組。(4) LY294002(40μM，48h)作用后caspase-8活性:對照組為99.71，藥物組為98.71，藥物組熒光強度值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，即LY294002作用下SKOV-3細胞中caspase-8的活性與對照組相比無差別。
　　 結(jié)論:LY294002引起的卵巢癌SKOV-3細胞凋亡增加，可能是其間接啟動凋亡線粒體途徑后引起caspase-9與easpase-3活性