PI3K抑制劑BKM120對乳腺癌多藥耐藥細胞抑制作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　1.對比研究單用PI3K抑制劑BKM120對乳腺癌化療藥物敏感細胞系和耐藥細胞系間的差異作用，了解BKM120對乳腺癌化療耐藥細胞體內(nèi)、體外的抑制作用，并進一步探討其對耐藥細胞發(fā)揮抗癌作用的作用機制。
　　2.在體內(nèi)、體外實驗中聯(lián)合應(yīng)用PI3K抑制劑BKM120及化療藥物阿霉素，以研究BKM120聯(lián)合常規(guī)化學(xué)治療藥物對乳腺癌化療耐藥細胞體內(nèi)、體外的抑制作用及其潛在的機制。
　　方法：
　　1.利用MT

2、T方法，比較BKM120和常見化療藥物對乳腺癌化療藥物敏感細胞系和耐藥細胞系間的差異作用，并通過Annexin V/P染色法，Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法等方法檢測BKM120對目標(biāo)細胞的凋亡誘導(dǎo)作用，同時使用實時定量PCR法檢測凋亡相關(guān)基因的mRNA水平改變；在機制研究中，采用Western-blotting檢測了PI3K/AKT/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的改變，免疫熒光實驗明確了NF-κB p65亞基

3、在BKM120作用后的總體表達量及定位的改變情況。分別以 ALDH及 CD44+/CD24-為乳腺癌干細胞標(biāo)志物，利用流式細胞儀檢測乳腺癌敏感細胞系及耐藥細胞系中干細胞比例，同時對比 BKM120單藥治療前后干細胞比例的改變。同時利用球囊培養(yǎng)技術(shù)及軟瓊脂克隆形成技術(shù)檢測BKM120對不同細胞系的干細胞體外成瘤能力的影響。構(gòu)建乳腺癌耐藥細胞株的體外移植瘤小鼠模型，將小鼠隨機分為對照組、BKM120組，檢測 BKM120單藥對于乳腺癌耐藥細

4、胞系的體內(nèi)抑制作用。
　　2.采用MTT方法檢測BKM120與阿霉素兩藥聯(lián)合對于乳腺癌敏感細胞系級耐藥細胞系中的作用，通過CalcuSyn軟件，進行Chou&Talalay法檢測聯(lián)合指數(shù)(CI)以明確BKM120與阿霉素兩藥之間的聯(lián)合作用方式。構(gòu)建乳腺癌耐藥細胞株的體外移植瘤小鼠模型，將小鼠隨機分為 BKM120單藥組、阿霉素單藥組以及兩藥聯(lián)合組，檢測 BKM120與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌耐藥細胞系的體內(nèi)移植瘤的抑制作用。

5、　　結(jié)果：
　　1.在以乳腺癌MDR細胞系MCF-7/A02和CalDOX，以及其對應(yīng)敏感細胞系MCF-7和Cal51為研究對象的MTT實驗中，發(fā)現(xiàn)BKM120對于敏感細胞系及耐藥細胞系均存在抑制作用，且呈濃度依賴性，二者之間IC50僅存在1.2-6.8倍的差異，遠小于常規(guī)化療藥物敏感和耐藥細胞系IC50間的差異?？寺⌒纬蓪嶒灆z測BKM120對上述細胞系的長期抑制作用發(fā)現(xiàn)：BKM120可長期抑制耐藥細胞系的生長能力。
　　2

6、.分別通過Annexin V/Propidium染色法，caspase-3/7活性檢測以及caspase-9檢測法等3種方法檢測BKM120對敏感細胞系及耐藥細胞系的凋亡誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn) BKM120對耐藥細胞系仍存在誘導(dǎo)凋亡的作用。在發(fā)生凋亡的機制研究中發(fā)現(xiàn)BKM120作用于耐藥細胞系后，mRNA水平上，survivin的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，而bim和bax顯著上調(diào)，在蛋白水平，BKM120可有效抑制PI3K/AKT通路活性，且N

7、F-κB p64亞基在總蛋白和核蛋白的表達均有所降低。
　　3.在BKM120單藥對耐藥細胞中干細胞亞群的作用分析發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞系中CD44+/CD24-細胞和ALDH+細胞的比例均顯著增加。當(dāng)BKM120分別作用于MCF-7/A02和CalDOX細胞時，CD44+/CD24-細胞和ALDH+細胞的比例均有所下降，且呈濃度依賴性。進一步研究BKM120對干細胞體外成瘤能力影響發(fā)現(xiàn)， BKM120作用后，耐藥細胞系MCF-7/A02

8、和CalDOX的球囊形成能力及克隆形成能力均顯著下降。
　　4.分別構(gòu)建 MCF-7/A02和 CalDOX細胞體外移植瘤裸鼠模型，可見與體外細胞學(xué)實驗結(jié)果一致，裸鼠在可耐受BKM120單藥治療的同時，BKM120可有效抑制移植瘤的增長，且可降低移植瘤中 pAKT蛋白及細胞核內(nèi) NF-κB p64亞基的表達。
　　5. BKM120聯(lián)合阿霉素分別作用于敏感細胞系和對應(yīng)的耐藥細胞系的研究中可見，BKM120與阿霉素在耐藥細胞系

9、中的協(xié)同作用更為顯著，而在敏感細胞系中兩藥聯(lián)合的協(xié)同作用較弱。在體外移植瘤模型中的結(jié)果與體外研究結(jié)果一致：兩藥聯(lián)合對體內(nèi)移植瘤的抑制作用得到了顯著增加。
　　結(jié)論：
　　1.在體內(nèi)體外實驗中，PI3K抑制劑 BKM120可有效抑制乳腺癌耐藥細胞系的生長增殖及成瘤能力，其發(fā)揮作用的機制可能存在以下2種：BKM120可通過抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路活性，抑制NF-κB入核，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡；BKM120可有效抑