力學環(huán)境對大鼠骨折愈合早期骨斷端MSCs募集和分化的影響.pdf

1、骨折愈合是指骨折、截骨、關節(jié)融合和骨移植術后的自然骨連接過程。骨折愈合的影響因素眾多，其中骨折區(qū)的力學環(huán)境是一個重要的方面，骨折經(jīng)適合固定后再誘發(fā)骨折端細微運動，能刺激骨痂生長，加速骨折愈合過程。然而，關于力學環(huán)境影響骨愈合過程的細胞生物學和分子生物學機制目前仍不甚清楚。本課題組早前在臨床治療中發(fā)現(xiàn)：完全固定不能加速骨折的痊愈，適當給予病人一定的活動量卻可以加速骨折愈合，并加速病人恢復肢體的功能。因此，探討骨折斷端的力學環(huán)境對骨折愈合過

2、程的影響不僅可理解骨折愈合機制，而且對臨床骨折的治療、康復具有重要的指導意義。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的具有多向分化潛能的成體干細胞，能夠向成骨、成軟骨細胞等方向分化，骨折損傷部位對MSCs的募集在骨修復中發(fā)揮重要的作用，骨折端募集足夠數(shù)量的MSCs是骨折愈合的前提條件和重要的細胞學基礎。研究力學環(huán)境對骨折端的干細胞募集和分化的影響對于從細胞水平和分子水平認識骨折愈合機制可提供

3、新證據(jù)，進而對臨床骨折的治療和康復過程的設計和力度控制具有實踐指導意義。
　　骨折愈合早期是力學刺激促進骨折愈合最為有效的時期，本實驗通過手術制備大鼠骨折動物模型，以不同剛度系數(shù)外固定架固定為骨折區(qū)提供不同力學環(huán)境的方法，利用流式細胞術、RT-qPCR、Western-blot等技術手段，觀察不同力學環(huán)境對骨斷端 MSCs募集和分化的影響。
　　研究目的：
　　1．通過建立不同剛度系數(shù)外固定架固定大鼠股骨骨折的實驗模型

4、，以給予骨折股骨不同的力學環(huán)境，觀察骨折愈合早期不同力學環(huán)境對骨斷端MSCs的募集是否產(chǎn)生不同影響，從細胞水平解釋不同力學環(huán)境對骨折愈合的影響。
　　2．從分子水平揭示骨折局部不同力學環(huán)境在骨折愈合早期對骨斷端MSCs向成骨細胞譜系和軟骨細胞譜系分化的不同影響。
　　3．為骨折愈合機制研究提供新的實驗數(shù)據(jù)，對臨床骨折的治療及康復中的力學控制設計提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1．建立大鼠股骨骨折模型，以不同剛

5、度系數(shù)的外固定架予以固定，設置對照組（剛度系數(shù)60.6 N/mm）、高剛度組（剛度系數(shù)18.2 N/mm）和低剛度組（剛度系數(shù)8.5 N/mm）。
　　2．于術后當天、2周后拍攝X-光片，觀察骨折愈合情況；術后6周，對骨痂組織進行組織學研究。
　　3．于術后2天、4天、6天、10天，將骨折斷端組織取出，分離并計數(shù)有核細胞。用流式細胞術檢測分離所得細胞中 MSCs所占的比例。計算得到三組不同天數(shù)骨斷端CD29+CD90+（MS

6、Cs）的絕對數(shù)目。
　　4．于術后2天、6天、10天、14天分別取骨痂組織，通過RT-qPCR檢測其中成骨相關基因Runx2、Osterix（OSX）及成軟骨相關基因Sox9的表達水平。并通過Western-blot檢測Runx2、Sox9蛋白的表達。觀察骨斷端力學環(huán)境對干細胞分化影響。
　　研究結果：
　　1．影像學研究顯示，術后2周時高剛度組骨痂量明顯少于低剛度組。組織學研究顯示，高剛度組大鼠股骨骨折模型均達到了骨

7、性鏈接，但骨痂較少。低剛度組大鼠股骨骨折模型出現(xiàn)了軟骨鏈接，但軟骨部分非常薄，最終沒有發(fā)生骨化。
　　2．隨愈合時間增加，分離得到有核細胞數(shù)目呈減少趨勢，流式細胞儀檢測結果顯示CD29+CD90+（MSCs）細胞比例不斷減少，最終計算得到MSCs的絕對數(shù)目2天>4天>6天>10天（P<0.05）；術后同天組間比較，低剛度組多于高剛度組，高剛度組多于對照組（P<0.05）。
　　3．Runx2、OSX的表達水平在14天之內不斷

8、升高。Sox9的表達，對照組和高剛度組在術后10天最高，14天有所下降，低剛度組在術后14天之內一直升高。14天之內Runx2、OSX及Sox9的表達水平組間基本低剛度組>高剛度組>對照組。
　　結論：
　　1．在骨折愈合早期，骨折區(qū)力學環(huán)境會影響募集的MSCs的數(shù)目。固定強度低時，骨折端微動多，募集的MSCs增多。
　　2．在骨折愈合早期，骨折區(qū)力學環(huán)境會影響 MSCs向成骨、成軟骨細胞譜系的分化。固定強度低時，骨折