五個棉花逆境相關鋅指蛋白基因的功能初步分析.pdf

1、棉花是世界上重要的經濟作物，是紡織工業(yè)最重要的天然原料。陸地棉是棉花最主要的栽培種，其產量占全球棉花總產量的90％以上。但是由于棉花的種植地區(qū)大都位于干旱和半干旱的地區(qū)，各種自然災害，比如干旱、鹽堿、低溫、枯黃萎病都嚴重制約著棉花產量和品質的提高。培育高抗的棉花品種是棉花育種的主要任務之一。
　　 鋅指蛋白是一類與鋅離子結合并折疊成手指狀結構的蛋白質的總稱，是轉錄因子數量最多的成員。鋅指結構域主要依靠半胱氨酸和組氨酸來結合鋅離子

2、，其排列順序決定了鋅指蛋白結合鋅離子的方式。鋅指結構域功能多樣，可以結合DNA、RNA、蛋白質和脂質，含有鋅指結構域的蛋白質參與生物體生命活動的各個環(huán)節(jié)。在植物中，有些鋅指蛋白，包括一些植物特有的鋅指蛋白，參與植物對生物和非生物脅迫的應答反應。
　　 我實驗室前期從棉花中克隆到5個鋅指類蛋白基因，分別為GhSAP1，GhBBX1，GhRCHY1，GhZFP2和GhZFP3。利用實時熒光定量PCR方法檢測供試的5個鋅指類基因在受到

3、非生物脅迫表達情況。結果表明:與對照相比，這5個GhZFPs類基因均極顯著受干旱、NaCl和ABA誘導表達。本研究以這5個鋅指類基因為研究對象，構建植物表達載體，將其轉入煙草中，探討它們在轉基因煙草中受干旱、鹽脅迫的表現，進而明確其功能。結果如下:
　　 1、利用pBI121載體，構建了35S啟動子分別啟動5個基因的植物表達載體，將其轉入煙草，分別得到每個基因10個克隆的T0代植株。通過不同濃度的Kan+篩選相應轉基因煙草的T1

4、代種子，獲得最佳Kan+抗性篩選濃度150mg/ml。進一步篩選獲得抗性的T1代植株。每一轉基因材料分別選取3個克隆系9個單株的T1代植株葉片提取DNA和RNA，通過PCR和RT-PCR檢測驗證獲得的T1代陽性植株的外源目標基因正常插入與表達。收到的T2代陽性自交種子，結合PCR驗證獲得所需的T2代純系植株。
　　 2、選擇每個轉基因載體各3個克隆純系的轉基因煙草進行鹽脅迫處理，檢測葉綠素含量，類胡蘿卜素含量，SOD活性，MDA

5、含量，蔗糖和總糖含量，K+/Na+等7個抗鹽相關指標。通過對轉基因材料的不同濃度鹽脅迫處理，確定最佳NaCl鹽脅迫處理濃度為200mM?；谠摑舛忍幚聿煌D基因煙草材料，抗鹽相關指標檢測結果表明:GhSAP1、GhZFP2、GhZFP3、 GhBBX1、GhRCHY1這五個基因的轉基因煙草在鹽脅迫下:所有轉基因植株的葉綠素含量極顯著高于野生型;轉GhBBX1植株的類胡蘿卜素含量極顯著高于野生型，轉GhSAP1、GhZFP2和GhRCHY

6、1的類胡蘿卜素顯著高于野生型，同時轉GhBBX1植株的類胡蘿卜素含量顯著高于轉GhSAP1、GhZFP2、GhZFP3植株的含量;所有轉基因植株的SOD活性極顯著地高于野生型，同時轉GhBBX1植株的活性極顯著地高于其他轉基因植株;所有轉基因植株的MDA含量極顯著低于野生型，同時轉GhBBX1和GhSAP1的MDA含量極顯著低于其他轉基因植株;所有轉基因植株的蔗糖和總糖含量都極顯著地高于野生型，轉GhBBX1的蔗糖含量極顯著地高于其他轉

7、基因植株，總糖含量顯著性高于其他轉基因植株;所有轉基因植株地上部分的K+/Na+極顯著地高于野生型，轉GhBBX1和GhZFP2地下部分K+/Na+極顯著地高于野生型。結果表明:在鹽脅迫下，轉基因植株光合作用色素合成能力比野生型強;滲透調節(jié)物質積累也比野生型多;清除活性氧的酶活比野生型高，同時質膜氧化產物比野生型低;能更好地將外界的Na+、K+從根部運輸到葉片，保持營養(yǎng)平衡。
　　 研究表明這五個基因的轉基因煙草其耐鹽性依次是:

8、GhBBX1、GhSAP1、GhRCHY1、GhZFP2和GhZFP3。
　　 3、選擇每個轉基因載體各3個克隆純系的轉基因煙草進行干旱脅迫處理，檢測葉綠素含量，類胡蘿卜素含量，SOD活性，MDA含量，蔗糖和總糖含量等6個抗旱相關指標。結果表明:GhSAP1、GhZFP2、GhZFP3、GhBBX1、GhRCHY1這五個基因的轉基因煙草在干旱脅迫下:轉GhSAP1、GhZFP2、GhZFP3、GhRCHY1植株的葉綠素含量極顯著

9、高于野生型;轉GhZFP2、GhZFP3植株的類胡蘿卜素顯著性高于野生型;所有轉基因植株的SOD活性極顯著地高于野生型，同時轉GhZFP2、GhZFP3植株的SOD活性極顯著地高于其他轉基因植株;所有轉基因植株的MDA含量極顯著低于野生型，同時轉GhZFP2、GhZFP3植株的MDA含量極顯著低于其他轉基因植株;所有轉基因植株的蔗糖和可溶性總糖含量極顯著高于野生型，轉GhZFP2、GhZFP3植株的含量極顯著高于其他轉基因植株。結果表明