α7nAChR在擠壓綜合征中的作用研究.pdf

1、研究目的：
　　擠壓傷指的是軀干或四肢受到擠壓，導(dǎo)致被擠壓部位肌肉腫脹和/或神經(jīng)功能失常。擠壓傷多發(fā)生于地震、車禍等。擠壓綜合癥則是指當(dāng)擠壓時間過長，被擠壓部位肌肉大量壞死，當(dāng)解除擠壓后，大量的細胞內(nèi)物質(zhì)從壞死肌肉釋放入血，導(dǎo)致代謝性酸中毒、高血K+癥、以及其他代謝性紊亂。同時壞死的肌肉組織吸收大量的水分，導(dǎo)致水鈉在局部潴留，從而引發(fā)低血容量性休克。擠壓綜合癥患者如果不及時治療，后期會出現(xiàn)腎衰竭。大地震時，擠壓綜合征的發(fā)生率約為2

2、～15％，是除了外傷以外導(dǎo)致死亡最主要的原因。高達20％的擠壓綜合癥患者死因是高血K+癥引起的心律失?；蛘叩脱萘啃孕菘恕５且驗樵呵皵D壓綜合征的診斷比較難，臨床缺乏降低擠壓綜合征患者早期死亡安全有效的藥物。
　　山莨菪堿是一種傳統(tǒng)的抗休克藥物，可以提高血液的微循環(huán)，臨床上多用于治療伴有血流障礙性的疾病，比如膿毒性休克和彌散性血管內(nèi)凝血障礙。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)山莨菪堿的抗休克作用主要是通過作用于M受體，使乙酰膽堿更多的和α7nAC

3、hR相結(jié)合，提高血壓而不改變心率，從而發(fā)揮抗炎抗休克作用。
　　胰島素在臨床上和葡萄糖合用，可以通過激活Na+/K+-ATPase促進血K+進入細胞而降低血K+濃度。有研究報道N受體激動劑尼古丁可以激活α7nAChR進而提高胰島素的敏感性，那么山莨菪堿能否通過α7nAChR的激活用于擠壓綜合征的預(yù)防給藥或者治療呢？
　　另外文獻報道擠壓傷發(fā)生時，高K+血癥主要見于成年男性，而E2可以降低血清K+濃度。E2可以通過作用于胰島素

4、信號通路提高心肌細胞Na+/K+-ATPase的表達和活性。但是，擠壓綜合征中E2和高K+血癥，E2和胰島素敏感性的關(guān)系未見報道。
　　本實驗的目的在于通過一系列的實驗探索:1、α7nAChR激活對擠壓綜合征死亡率的影響及其機制研究;2、E2在α7nAChR激活對擠壓綜合征的預(yù)防作用中扮演的角色。
　　研究方法：
　　1、山莨菪堿對擠壓綜合征大鼠死亡率及血生化和電解質(zhì)指標(biāo)的影響
　　用SD大鼠制做擠壓綜合征模型。

5、正常組:生理鹽水;對照組:擠壓+生理鹽水;預(yù)防給藥組:解除擠壓前30min給予山莨菪堿;治療給藥組:解除擠壓后1h給予山莨菪堿。解除擠壓后觀察SD大鼠24 h死亡率。另外造模，解除擠壓后6h眶靜脈叢取血，靜置、離心得到血清，檢測血清K+、Na+、Cl-、Scr、CK、CK-MB和BUN水平。
　　2、山莨菪堿對擠壓綜合征大鼠胰島素敏感性的影響
　　用SD大鼠制做擠壓綜合征模型。正常組:生理鹽水;對照組:擠壓+生理鹽水;預(yù)防給

6、藥組:解除擠壓前30 min給予山莨菪堿。解除擠壓后6h眶靜脈叢取血，靜置、離心得到血清，檢測血清胰島素和葡萄糖水平。
　　3、α7nAChR參與了山莨菪堿對擠壓綜合征死亡率、血清K+和胰島素敏感性的作用
　　工具藥:α7nAChR激動劑PNU和抑制劑MLA。用C57BL/6小鼠制做擠壓綜合征模型。對照組:造擠壓綜合征模型并給予等量的生理鹽水;預(yù)防給藥組:解除擠壓前30 min給予山莨菪堿。MLA組:解除擠壓前30 min給

7、予MLA;山莨菪堿+MLA:解除擠壓前1h給予MLA，解除擠壓前30 min給予山莨菪堿;PNU組:解除擠壓前30 min給予PNU。解除擠壓后觀察C57BL/624 h死亡情況。另外同樣的五組，解除擠壓后6h取血，靜置、離心得到血清，檢測血清K+，胰島素和葡萄糖水平。同時檢測正常小鼠血清K+，胰島素和葡萄糖水平。
　　4、用α7nAChR-/-小鼠驗證α7nAChR參與了山莨菪堿對擠壓綜合征死亡率、血清K+和胰島素敏感性的作用<

8、br>　　用α7nAChR+/+和α7nAChR-/-小鼠制做擠壓綜合征模型。野生型和純合子各分為兩組，對照組:造擠壓綜合征模型并給予等量的生理鹽水;預(yù)防給藥組:解除擠壓前30 min給予山莨菪堿。解除擠壓后6h取血，靜置、離心得到血清，檢測血清K+，胰島素和葡萄糖水平。另外同樣的四組，解除擠壓后觀察24 h死亡情況。
　　5、山莨菪堿對高K+血癥大鼠死亡率和血清K+的作用
　　對照組:生理鹽水，30 min后給予KCl;實

9、驗組:給予山莨菪堿，30 min后給予同樣的KCl。30 min后取血，檢測血清K+濃度。同樣的另外兩組觀察24 h死亡情況。
　　6、α7nAChR參與了山莨菪堿對細胞外高K+的作用
　　成肌細胞分成五組:山莨菪堿組，乙酰膽堿組，山莨菪堿+乙酰膽堿組，尼古丁組和PNU組。在細胞培養(yǎng)基中加入外源性K+造高K+模型。給藥時間在加入K+之前30 min。K+加入6h后取培養(yǎng)基檢測K+和葡萄糖濃度。同樣的用N受體抑制劑Mec和除α

10、7nAChR以外的N受體阻斷劑Hex探究α7nAChR的作用。
　　7、胰島素信號通路介導(dǎo)山莨菪堿降低細胞外高K+的作用
　　HNMPA-(AM)3:胰島素受體抑制劑。C2C12骨骼肌成纖維細胞分成五組:正常組，對照組，山莨菪堿+乙酰膽堿，HNMPA-(AM)3和山莨菪堿+乙酰膽堿+HNMPA-(AM)3組。免疫熒光檢測HNMPA-(AM)3對Na+/K+-ATPase在細胞膜表面分布的影響。
　　使用胰島素受體抑制劑

11、HNMPA-(AM)3、mTOR抑制劑雷帕霉素、PI3K抑制劑LY294002、轉(zhuǎn)錄活化因子Stat3抑制劑Stattic和Na+/K+-ATPase抑制劑哇巴因探究胰島素/Na+/K+-ATPase通路對細胞外高K+的作用。
　　8、擠壓綜合征死亡率、雌激素、胰島素敏感性和血清K+的性別差異
　　雌雄小鼠各半造擠壓綜合征模型，觀察24 h小鼠死亡情況。另外造模，解除擠壓后6h取血，測量雌雄小鼠E2、血清K+、胰島素和葡萄糖

12、水平。
　　9、α7nAChR的激活對擠壓綜合征小鼠血清K+和E2的影響
　　工具藥:α7nAChR抑制劑MLA。用C57BL/6小鼠制做擠壓綜合征模型。對照組:造擠壓綜合征模型并給予等量的生理鹽水;預(yù)防給藥組:解除擠壓前30 min給予山莨菪堿。MLA組:解除擠壓前30 min給予MLA;山莨菪堿+MLA:解除擠壓前1h給予MLA，解除擠壓前30 min給予山莨菪堿。解除擠壓后6h取血，靜置、離心得到血清，檢測血清K+濃度

13、、胰島素和葡萄糖水平。同時檢測正常小鼠血清K+濃度、胰島素和葡萄糖水平。
　　10、卵巢摘除術(shù)對擠壓綜合征小鼠血清K+、E2和胰島素敏感性的影響
　　假手術(shù)組和手術(shù)組各分成四組:正常組、擠壓組、山莨菪堿組和E2組。后三組均擠壓。取血，檢測血清K+和E2水平。另外假手術(shù)組和手術(shù)組各再造模分組:擠壓組、山莨菪堿組和E2組。
　　11、E2對擠壓綜合征小鼠死亡率的影響
　　假手術(shù)組和手術(shù)組各再造模分組:擠壓組、山莨菪堿

14、組和E2組。監(jiān)測解除擠壓后24 h死亡情況。
　　12、探究山莨菪堿對擠壓綜合征大鼠血壓的影響以及α7nAChR在其中發(fā)揮的作用
　　SD大鼠分成五組:正常組、對照組、MLA組、山莨菪堿組和MLA+山莨菪堿組。后四組接受擠壓。解除擠壓前，各組先測量一段大鼠血壓和心率，解除擠壓后持續(xù)監(jiān)測3.5h再停止測量。記錄分析。
　　實驗結(jié)果：
　　1、和不給藥組相比，解除擠壓前30 min和解除擠壓后1h給予山莨菪堿可以顯著

15、降低擠壓綜合征大鼠24 h死亡率以及擠壓綜合征大鼠血清K+、Scr、CK、CK-MB和BUN水平
　　2、和不給藥組相比，給予山莨菪堿可以提高擠壓綜合征大鼠胰島素敏感性。
　　3、山莨菪堿降低擠壓綜合征小鼠24 h死亡率的作用可以被α7nAChR抑制劑MLA阻斷。而α7nAChR激動劑PNU可以顯著降低擠壓綜合征小鼠24 h死亡率。PNU提高擠壓綜合征小鼠胰島素敏感性，MLA降低擠壓綜合征小鼠胰島素敏感性。
　　4、山

16、莨菪堿可以降低野生型擠壓綜合征小鼠24 h死亡率，但是對純合子擠壓綜合征小鼠24 h死亡率沒有顯著作用。
　　5、山莨菪堿預(yù)防給藥可以通過降低血K+降低高血K+癥大鼠死亡率。
　　6、山莨菪堿單用、山莨菪堿和乙酰膽堿合用均可降低細胞外高K+和葡萄糖濃度。山莨菪堿和乙酰膽堿合用比山莨菪堿單用效果更明顯。Mec和MLA可以阻斷這一作用。尼古丁和PNU單用均可以降低細胞外高K+和葡萄糖濃度。
　　7、山莨菪堿+乙酰膽堿使更多

17、的Na+/K+-ATPase磷酸化，而胰島素受體抑制劑HNMPA-(AM)3可以阻斷這一作用。HNMPA-(AM)3、雷帕霉素、LY294002、Stattic和哇巴因可阻斷山莨菪堿和乙酰膽堿降低細胞外高K+的作用。
　　8、擠壓綜合征雌性小鼠和雄性小鼠死亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是擠壓以后雌性小鼠血清K+低于雄性小鼠，E2水平高于雄性小鼠，胰島素敏感性高于雄性小鼠。
　　9、α7nAChR的激活可以降低擠壓綜合征小鼠血清K+

18、濃度及提高血清E2的濃度。
　　10、卵巢摘除術(shù)可以提高擠壓綜合征小鼠血清K+濃度，降低胰島素敏感性，降低血清E2濃度。
　　11、E2可以降低擠壓綜合征小鼠死亡率。
　　12、山莨菪堿升高擠壓綜合征大鼠血壓，MLA可以阻斷山莨菪山莨菪堿的這一作用。山莨菪堿對擠壓綜合征大鼠心率沒有影響。
　　研究結(jié)論:α7nAChR的激活可以降低擠壓綜合癥早期死亡率，這種作用部分是通過胰島素/Na+/K+-ATPase信號通路介