α7 nAChR在尼古丁促HERS-ERM凋亡中的作用研究.pdf

1、牙周炎是口腔兩大類主要疾病之一,主要表現(xiàn)為牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收及牙骨質(zhì)破壞,嚴(yán)重者可導(dǎo)致牙齒松動脫落[1-4],是成人牙齒喪失的主要原因。大量研究證實吸煙是牙周病尤其重度牙周炎的高危因素[1,6-11],吸煙者較非吸煙者的牙周炎患病率高、病情重,且治療的預(yù)后不好,但吸煙引起牙周炎的確切機制仍不明確[1,8,12-14]。
　　牙根發(fā)育過程中赫特維希上皮根鞘(HERS)發(fā)生斷裂,牙囊細(xì)胞穿過根鞘上皮并分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞,

2、形成牙骨質(zhì);剩余的HERS離開牙根表面,形成HERS/ERM細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)HERS/ERM細(xì)胞可發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞,參與牙骨質(zhì)修復(fù)。多項研究證實牙周炎患者牙骨質(zhì)厚度、表面形貌、微區(qū)成分及顯微硬度均發(fā)生了改變[15-17]。尼古丁作為煙草中的主要毒性成分,多項研究已證實其在促進牙齦及牙周膜的炎性反應(yīng)、加快牙槽骨喪失過程中發(fā)揮著重要作用[1-4];然而,關(guān)于尼古丁影響牙骨質(zhì)修復(fù)的相關(guān)研究鮮有報道。本實驗擬觀察尼古丁可能通過α7

3、 nAChR影響HERS/ERM細(xì)胞凋亡,進而可能影響牙骨質(zhì)修復(fù)過程,以闡明吸煙影響牙周炎患者牙骨質(zhì)修復(fù)的可能機制。
　　本課題通過建立實驗性牙周炎大鼠模型和原代分離培養(yǎng)HERS/ERM細(xì)胞,采用HE染色觀察尼古丁對大鼠牙周組織和HERS/ERM細(xì)胞的影響,采用TUNEL染色、反轉(zhuǎn)錄PCR、實時定量PCR觀察尼古丁對HERS/ERM細(xì)胞凋亡的影響及凋亡相關(guān)基因mRNA的表達,以探討尼古丁是否可通過α7 nAChR促進HERS/ER

4、M細(xì)胞凋亡,進而影響牙周炎中牙骨質(zhì)的修復(fù)過程。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　實驗一尼古丁對實驗性牙周炎大鼠牙周組織HERS/ERM細(xì)胞的影響
　　1材料和方法：
　　將16只6周齡的SD大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥麻醉、固定,絲線結(jié)扎大鼠上頜右側(cè)第二磨牙頸部,成功建立大鼠實驗性牙周炎動物模型。隨機分為2組,分別腹腔注射等量生理鹽水(A組)和尼古丁(B組)。實驗第28d時處死大鼠,分離出雙側(cè)上頜磨牙區(qū)牙體牙周組織,制作石蠟切片

5、,行HE染色,觀察尼古丁對牙周組織炎性反應(yīng)、牙槽骨吸收及HERS/ERM細(xì)胞的影響。
　　2結(jié)果：
　　HE染色可觀察到兩組的結(jié)扎側(cè)牙周組織均有不同程度的炎細(xì)胞浸潤,尼古丁組較重,而非結(jié)扎側(cè)未見明顯炎癥反應(yīng);且較對照組相比,尼古丁組牙槽骨顯著發(fā)生吸收;根分叉附近有HERS/ERM細(xì)胞的存在,且尼古丁組大鼠牙周組織中HERS/ERM細(xì)胞數(shù)量較生理鹽水組顯著減少。
　　3結(jié)論：
　　成功建立實驗性牙周炎大鼠模型,尼古

6、丁可使HERS/ERM細(xì)胞數(shù)量減少,進而可能影響牙骨質(zhì)的修復(fù)過程。
　　實驗二大鼠磨牙HERS/ERM細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　1材料和方法：
　　選取出生后7天(postnatal7 day,PN7d)的SD大鼠,斷頸處死后提取磨牙上皮根鞘組織。dispaseⅡ蛋白酶和I型膠原酶消化,六孔板接種組織塊行原代細(xì)胞培養(yǎng),選擇性胰酶消化法去除成纖維細(xì)胞而獲得純化的上皮細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞的上皮來源。
　　2結(jié)果

7、：
　　原代細(xì)胞培養(yǎng)3-7d,鏡下可見組織塊周圍有多角形上皮細(xì)胞和梭形成纖維細(xì)胞混合存在,選擇性胰酶消化傳代后可見多角形上皮細(xì)胞連接緊密、聚集生長似鋪路石樣排列,梭形成纖維細(xì)胞基本去除;免疫細(xì)胞化學(xué)證實角蛋白表達陽性。
　　3結(jié)論：
　　成功分離培養(yǎng)大鼠磨牙HERS/ERM細(xì)胞,角蛋白染色證明其上皮來源,為進一步研究尼古丁影響HERS/ERM細(xì)胞的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　實驗三尼古丁對大鼠磨牙HERS/ERMα

8、7 nAChR表達的影響
　　1材料和方法：
　　選取成功分離培養(yǎng)的大鼠磨牙HERS/ERM細(xì)胞接種于六孔板,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HERS/ERM細(xì)胞α7 nAChR的表達,反轉(zhuǎn)錄PCR和實時定量PCR檢測各組細(xì)胞在α7 nAChR激動劑尼古丁(10-5M)和/或拮抗劑α-BTX(10-8M)的作用下α7 nAChR的表達情況。
　　2結(jié)果：
　　免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示HERS/ERM細(xì)胞存在α7 nAChR陽性表達;

9、反轉(zhuǎn)錄PCR及實時定量PCR結(jié)果顯示,大鼠磨牙HERS/ERM細(xì)胞存在α7 nAChR mRNA表達;尼古丁可上調(diào)大鼠磨牙HERS/ERM細(xì)胞α7 nAChR mRNA表達,α7 nAChR特異性拮抗劑α-BTX可拮抗上調(diào)的α7 nAChR mRNA表達水平。
　　3結(jié)論：
　　大鼠磨牙HERS/ERM細(xì)胞存在α7 nAChR的表達,且尼古丁可上調(diào)其mRNA表達,α-BTX可拮抗此效應(yīng)。提示α7 nAChR介導(dǎo)了尼古丁對大鼠

10、磨牙HERS/ERM細(xì)胞的作用。
　　實驗四尼古丁對大鼠磨牙HERS/ERM細(xì)胞凋亡作用的研究
　　1材料和方法：
　　選取成功分離培養(yǎng)的大鼠磨牙HERS/ERM細(xì)胞,TUNEL染色觀察尼古丁對HERS/ERM細(xì)胞的凋亡效應(yīng);反轉(zhuǎn)錄PCR及實時定量PCR檢測各組細(xì)胞分別在α7 nAChR激動劑尼古丁(10-5M)和/或特異性拮抗劑α-BTX(10-8M)的作用下bcl-2和bax mRNA的表達情況。
　　2結(jié)果

11、：
　　TUNEL染色結(jié)果顯示尼古丁可使HERS/ERM細(xì)胞脫水,胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞體積減小,細(xì)胞核固縮、斷裂。反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示:與對照組相比,10-5M尼古丁明顯上調(diào)大鼠磨牙HERS/ERM細(xì)胞bax mRNA表達,下調(diào)bcl-2 mRNA表達。實時定量PCR進一步驗證了該實驗結(jié)果,且bax和bcl-2 mRNA的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3結(jié)論：
　　尼古丁可促進HERS/ERM細(xì)胞凋亡,且尼古