副溶血性弧菌耐藥性調(diào)查及對(duì)喹諾酮類藥物耐藥變異特征的研究.pdf

1、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）是非常重要的人獸共患病原菌之一，主要來源于海水及海產(chǎn)品中。該菌常引起腹瀉、惡心、發(fā)熱等典型的胃腸炎型癥狀，關(guān)于其致病機(jī)制尚未完全闡明，耐熱直接溶血素(TDH)、耐熱相關(guān)溶血素(TRH)是目前公認(rèn)的副溶血性弧菌主要毒力因子。近年來，養(yǎng)殖業(yè)及臨床上抗生素的不規(guī)范使用也導(dǎo)致副溶血性弧菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且國內(nèi)外缺乏耐藥性流行病學(xué)連續(xù)性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，在耐

2、藥機(jī)制方面的研究也較少。本研究對(duì)107株不同來源的副溶血性弧菌毒力基因分布、耐藥性進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，并通過體外梯度誘導(dǎo)建立耐藥株模型，經(jīng)突變分析研究喹諾酮耐藥機(jī)制。具體研究方法和結(jié)果如下:
　　(1)利用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)107株分離株完成菌株鑒定，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行毒力基因的篩查，其中tlh基因在所有分離株中均有檢出，tdh、trh陽性率分別為18.7％(20/107)、8.4％(9/107)

3、，orf8攜帶率介于兩者之間，為15％(16/107)，且orf8+株全部表現(xiàn)為tdh+，且臨床分離株的毒力基因陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于環(huán)境分離株。通過設(shè)計(jì)引物對(duì)107株分離株VPA0166（編碼推測(cè)外膜蛋白基因）進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有55株是a型(996bp)陽性，52株是b型(1050bp)陽性。經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)a型產(chǎn)物中在523至580bp之間有54個(gè)堿基缺失，b型序列與已發(fā)表基因組序列的副溶血性弧菌RIMD2210633上的相應(yīng)序列同源

4、性達(dá)99％，說明b型菌株在進(jìn)化過程中與測(cè)序菌株更接近。此外，VPA0166多樣性與tdh和trh基因的攜帶具有相關(guān)性，全部tdh+菌株屬于b型，而trh+菌株均屬于a型。
　　(2)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅有對(duì)頭孢西丁、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥株檢出，對(duì)頭孢西丁的耐藥率為1.9％(2/107)，有一株對(duì)四環(huán)素和復(fù)方新諾明同時(shí)完全耐藥（基因型為tdh-trh-orf8-），對(duì)頭孢西丁和環(huán)丙沙星的中敏感率較高，分別達(dá)94.4％(101/1

5、07)、44.9％(48/107)。其中tdh+trh-/tdh-trh+型菌株對(duì)環(huán)丙沙星的中敏感率(51.7％)比tdh-trh-型菌株(41.9％)占比高約10個(gè)百分點(diǎn)，推測(cè)在抗生素選擇壓力下潛在致病性副溶血性弧菌比不帶毒菌株有更好耐受能力。此外，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在VPA0166a型、b型菌群對(duì)環(huán)丙沙星中介敏感率分別為23.6％、67.3％，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明b型菌株對(duì)環(huán)丙沙星更趨于耐藥，在長期抗生素作用下更有可

6、能發(fā)展為優(yōu)勢(shì)菌群。
　　(3)以耐藥性、VPA0166基因型為參考，選擇40個(gè)分離株利用PCR方法擴(kuò)增染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因，發(fā)現(xiàn)parE基因75位的突變與低水平耐藥有關(guān)，多藥外排泵NorM的96位和117位是與環(huán)丙沙星耐藥機(jī)制相關(guān)的突變點(diǎn)。此外，對(duì)全部分離株進(jìn)行質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因(PMQR)檢測(cè)，共檢出10株P(guān)MQR陽性菌株，陽性率為9.3％(10/107)，其中qnrC、qnrS、qnr VC基因陽性率分別為5.6

7、％(6/107)、0.9％(1/107)、2.8％(3/107)，且都存在堿基突變。通過在環(huán)丙沙星梯度培養(yǎng)基中連續(xù)傳代篩選，建立穩(wěn)定可靠的耐藥株模型，其最低抑菌濃度MIC升高了64～128倍。在對(duì)喹諾酮決定區(qū)(QRDR)基因和主動(dòng)外排泵檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)gyrB、parE均未發(fā)生突變，gyrA基因的第83位點(diǎn)Ser→Ile突變頻率最高，廣泛存在于高度耐藥株中，是作用的主要靶位基因，當(dāng)環(huán)丙沙星MIC為16μg/mL時(shí)核苷酸第369位存在ACC→A