胎肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究.pdf

1、本文研究了胎肝干細(xì)胞的特性，并誘導(dǎo)其分化為胰島素分泌細(xì)胞，著重進(jìn)行了胎肝干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，探討胎肝干細(xì)胞的生物學(xué)特性和性質(zhì)，以及胚胎發(fā)育中胎肝前體細(xì)胞的類型；采用階段性化學(xué)誘導(dǎo)、生物誘導(dǎo)以及二者相結(jié)合的方法，啟動胰腺發(fā)育的相關(guān)基因，使胎肝干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞。 全文共分四個部分。 第一部分，胎肝干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。 通過體外分離培養(yǎng)并擴(kuò)增大鼠胎肝干細(xì)胞，研究其形態(tài)、生物學(xué)特性，采用免疫細(xì)胞化學(xué)分析

2、胎肝干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，初步研究胎肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)條件，并探討肝臟的發(fā)生發(fā)育及肝干細(xì)胞的性質(zhì)及增殖潛能。 本實(shí)驗(yàn)選取胎齡12～16dSD大鼠，先用機(jī)械分離結(jié)合酶消化法分離培養(yǎng)胎肝細(xì)胞，繼而用特異的干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行克隆篩選法獲得了數(shù)量較多、較純化的胎肝干細(xì)胞克隆。SABC法檢測原代、傳代后及細(xì)胞克隆中的肝干細(xì)胞特異表面標(biāo)志物OV-6、CK-19及胰腺前體細(xì)胞特異標(biāo)志蛋白Nestin的表達(dá)。 以上研究表明，

3、胎肝干細(xì)胞可通過克隆篩選法進(jìn)行體外擴(kuò)增，含有特殊細(xì)胞因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基有助于肝干細(xì)胞的擴(kuò)增，可獲得較好的效果。培養(yǎng)3d左右開始出現(xiàn)小細(xì)胞團(tuán)，1個月即形成肉眼可見的細(xì)胞集落，5～7d傳代一次。原代、傳代培養(yǎng)的胎肝細(xì)胞部分表達(dá)OV-6、CK-19及Nestin；細(xì)胞克隆幾乎全部為干細(xì)胞標(biāo)志陽性細(xì)胞，表明胎肝干細(xì)胞具有較強(qiáng)的分裂增殖能力。胎肝內(nèi)存在Nestin陽性干細(xì)胞，我們稱之為肝源性Nestin陽性祖細(xì)胞(nestin-positiveh

4、epatic-derivedprogenitor，NHPcells)，可能是一種更為原始的干細(xì)胞在胚胎發(fā)育中起重要作用。 第二部分，胎肝組織細(xì)胞的鑒定及分類。 本部分實(shí)驗(yàn)旨在研究胎肝干細(xì)胞性質(zhì)的同時也為肝干細(xì)胞進(jìn)行較系統(tǒng)的分類提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探討肝臟中干/祖細(xì)胞的類型并篩選出易于向胰腺方向分化的細(xì)胞類型，為下一步的誘導(dǎo)獲取較佳的種子細(xì)胞。 采用免疫熒光雙標(biāo)記法，針對OV-6、CK-19及Nestin三種抗體中二種抗

5、體的不同組合，F(xiàn)ITC和Cy3分別標(biāo)記，DAPI染核，針對胎肝組織和原代、傳代及克隆培養(yǎng)的細(xì)胞中不同的前體細(xì)胞類型進(jìn)行初步的定位及分類。 胎肝中包含了從原始到成熟不同發(fā)育程度的各種肝臟細(xì)胞：(1)多能前體細(xì)胞：OV-6+nestin+CK-19-細(xì)胞，可能具有肝胰多向分化潛能；(2)雙能前體細(xì)胞：OV-6+CK-19+nestin-細(xì)胞，是肝臟的雙能干細(xì)胞，可分化為肝細(xì)胞系和膽管細(xì)胞系；(3)定向前體細(xì)胞或過渡細(xì)胞：僅表達(dá)OV-

6、6或僅表達(dá)CK-19，可能分別是僅有向肝臟方向分化能力的肝前體細(xì)胞和向膽管方向分化的細(xì)胞，或是正在分化為成熟細(xì)胞的過渡階段；(4)較成熟細(xì)胞。體外獲得的nestin+細(xì)胞數(shù)量較少，大多是與OV-6一同表達(dá)，僅表達(dá)nestin的細(xì)胞數(shù)量很少。OV-6+nestin+細(xì)胞和nestin+細(xì)胞可能具有向胰腺細(xì)胞分化的潛能，從胰島發(fā)育的過程推測β細(xì)胞與肝細(xì)胞有共同的來源，它們共同的祖細(xì)胞是胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)和肝內(nèi)的nestin陽性細(xì)胞。因此我們選取

7、此類肝源性nestin陽性祖細(xì)胞作為下一步誘導(dǎo)分化的種子細(xì)胞。 第三部分，EGFP-PDX-1融合表達(dá)載體電穿孔轉(zhuǎn)染大鼠胎肝干細(xì)胞的研究。 本室構(gòu)建了PDX-1綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體，通過電穿孔轉(zhuǎn)染入大鼠胎肝干細(xì)胞以得到較穩(wěn)定的表達(dá)，期望借助于外源性生物因子啟動胎肝干細(xì)胞中PDX-1基因的表達(dá)，從生物誘導(dǎo)方面研究胰腺內(nèi)分泌發(fā)育的關(guān)鍵基因PDX-1在肝干細(xì)胞定向分化中的調(diào)控機(jī)制，為今后定向分化的深入研究提供物質(zhì)平臺。

8、 由PDX-1插入pEGFP-Cl的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-PDX-1用電穿孔法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠胎肝干細(xì)胞，分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的生長曲線，熒光顯微鏡下觀察GFP發(fā)光情況，RT-PCR鑒定PDX-1基因的表達(dá)情況。 經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染后GFP和PDX-1的融合蛋白能在胎肝干細(xì)胞中一起表達(dá)，并維持較長的時間，對胎肝干細(xì)胞的生長增殖無顯著影響(P＞0.05)。構(gòu)建的PDX-1綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體能在胎肝干細(xì)胞中較

9、持續(xù)地表達(dá)，為研究PDX-1在干細(xì)胞定向分化為胰島素分泌細(xì)胞中的調(diào)控作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 第四部分，胎肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究。 采用階段特異性的化學(xué)誘導(dǎo)、生物誘導(dǎo)以及二者相結(jié)合的方法，模擬胰腺發(fā)育的內(nèi)外環(huán)境，使胎肝干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞，并探討肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的內(nèi)源性及外源性調(diào)控機(jī)制。 將篩選出的nestin陽性胎肝細(xì)胞分組誘導(dǎo)，分別進(jìn)行分階段的以Nicotinamide為誘導(dǎo)

10、劑的化學(xué)誘導(dǎo)、電穿孔轉(zhuǎn)染PDX-1基因的生物誘導(dǎo)、生物誘導(dǎo)后化學(xué)誘導(dǎo)以及未誘導(dǎo)組。ELISA檢測細(xì)胞上清液中胰島素的含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后換算出各組細(xì)胞釋放的胰島素量并比較；RT-PCR檢測與胰腺發(fā)育相關(guān)的基因和肝細(xì)胞特異基因在各組的表達(dá)情況。 Nestin+胎肝細(xì)胞經(jīng)生物、化學(xué)及二者結(jié)合法誘導(dǎo)后分泌的胰島素量分別為0.539、0.943和5.58ng/ml上清液(1×105細(xì)胞)，與陰性對照組相比均有顯著性差異(P=0.000)

11、，其中任意兩組相比也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。各誘導(dǎo)組均表達(dá)胰島素Ⅰ、GLUT-2及肝干細(xì)胞標(biāo)志HNF-1、AFP和c-met，而不表達(dá)胰高血糖素、生長抑素和ALB。生物誘導(dǎo)組和生化誘導(dǎo)組表達(dá)PDX-1和胰島素Ⅱ，化學(xué)誘導(dǎo)組弱表達(dá)這兩個基因。生化誘導(dǎo)法通過模擬細(xì)胞內(nèi)外的微環(huán)境能獲得較高的胰島素分泌水平，并表達(dá)一系列胰腺發(fā)育相關(guān)的基因，但是，nestin+胎肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的機(jī)制還需更深入的研究，以實(shí)現(xiàn)胰島素的生理性分