胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)及糖尿病細(xì)胞移植治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(ES)是一種來(lái)源于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的全能型干細(xì)胞，具有分化為各種組織細(xì)胞的潛能，在適宜的條件下可分化為人們需要的細(xì)胞用于某些疾病的治療。 糖尿病是由于胰島β-細(xì)胞破壞或胰島素抵抗所致的胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏。補(bǔ)充胰島素是Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的傳統(tǒng)治療手段。胰島素治療雖能控制癥狀、延緩和減少并發(fā)癥的發(fā)生，但不能使糖尿病徹底治愈。利用ES細(xì)胞的全能分化特性，將ES細(xì)胞定向地誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞(IPC)用于糖尿病的治療，有可能

2、使糖尿病得到治愈。 多項(xiàng)研究表明，ES細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為具有胰島素分泌功能的IPC，這些細(xì)胞移植給糖尿病小鼠后有一定的治療作用，這為糖尿病的細(xì)胞移植治療帶來(lái)了希望。但由ES細(xì)胞誘導(dǎo)生成的IPC數(shù)量少、功能較差、誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)、誘導(dǎo)過(guò)程復(fù)雜，與臨床運(yùn)用的要求尚有一定差距。 胰腺十二指腸同源盒-1基因(pdx-1)是調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育和胰島β細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因，也是維持正常胰島β細(xì)胞生理功能不可缺少的基因。用pdx-1基因轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干

3、細(xì)胞，使之高表達(dá)pdx-1，有可能增加ES細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)化率，提高其胰島素的分泌功能。 為了縮短IPC的誘導(dǎo)周期，簡(jiǎn)化誘導(dǎo)方法，提高IPC的獲得量和胰島素分泌功能，我們構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因的pdx-1基因真核表達(dá)載體，將pdx-1轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞后在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中獲得了表達(dá)；經(jīng)過(guò)對(duì)ES細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增和ES細(xì)胞向IPC分化誘導(dǎo)的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)觀察，我們改進(jìn)了胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，縮短了誘導(dǎo)時(shí)間；將胰島素分泌細(xì)胞移

4、植于糖尿病小鼠后，這些細(xì)胞能在小鼠體內(nèi)存活增殖，并使血糖恢復(fù)正常。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、從孕小鼠分離胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，純化后用于ES細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備。發(fā)現(xiàn)胎齡13.5d的胚胎用于分離MEF效果最好，大于15d或小于11d的胚胎均不能得到數(shù)量足夠、增殖能力旺盛的MEF；在進(jìn)行絲裂霉素C(MMC)處理時(shí)，第2-4代MEF用10μg/ml濃度的MMC在37℃處理60min-90min為宜。 采用MEF飼養(yǎng)層和白血病抑

5、制因子(LIF)相結(jié)合的方法培養(yǎng)ES細(xì)胞，可有效地防止ES細(xì)胞的分化。在MEF飼養(yǎng)層上，ES接種4d之內(nèi)可以保持旺盛的增殖而不發(fā)生分化；連續(xù)培養(yǎng)4d之后，ES細(xì)胞出現(xiàn)不同程度分化，并逐步消失；進(jìn)行無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)時(shí)，ES增殖緩慢并容易出現(xiàn)早期分化，難于在無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期維持。 2、從小鼠胰腺組織提取總RNA后，用RT-PCR法擴(kuò)增了876bp長(zhǎng)度的小鼠pdx-1基因cDNA，經(jīng)過(guò)電泳、回收、純化后與攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因的質(zhì)

6、粒載體pEGFP-N1重組成新的載體pEGFP/pdx-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后在細(xì)菌中擴(kuò)增質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)質(zhì)粒抽提，酶切，電泳分析和DNA測(cè)序鑒定，876bp的pdx-1基因片段成功插入到載體中，插入方向正確。和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)后確認(rèn)無(wú)誤，說(shuō)明載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，24h后可見(jiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)，但較弱；轉(zhuǎn)染48h后，報(bào)告基因表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染

7、細(xì)胞有pdx-1表達(dá)。轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞轉(zhuǎn)種于新的飼養(yǎng)層上進(jìn)行G418抗性篩選，在含G418300μg/ml的ES培養(yǎng)基中，有少量ES集落存活并能夠傳代。轉(zhuǎn)染4d后，報(bào)告基因不再繼續(xù)表達(dá)，pdx-1的表達(dá)也消失。但ES細(xì)胞依然可以在含G418300μg/ml的ES培養(yǎng)基存活。 3、ES細(xì)胞在飼養(yǎng)層上擴(kuò)增4d后消化為單細(xì)胞，在不含LIF的EB培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)4d，形成胚胎體(EB)，收集EB進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。待EB貼壁后用無(wú)血清的神經(jīng)前體

8、細(xì)胞(NPC)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行NPC誘導(dǎo)。72h內(nèi)，大量細(xì)胞死亡、脫落，剩余細(xì)胞分化為上皮樣細(xì)胞或神經(jīng)元樣細(xì)胞。誘導(dǎo)第4d，大部分細(xì)胞呈神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)，經(jīng)nestin免疫組化染色鑒定，剩余的細(xì)胞大部分為nestin陽(yáng)性細(xì)胞。誘導(dǎo)5d后，細(xì)胞數(shù)量減少，剩余細(xì)胞呈典型的神經(jīng)元樣形態(tài)。 經(jīng)NPC培養(yǎng)基誘導(dǎo)4d的細(xì)胞更換為無(wú)血清的胰島素分泌細(xì)胞(IPC)選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)行IPC誘導(dǎo)。培養(yǎng)3d后，神經(jīng)元樣細(xì)胞減少，但從多突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞

9、的周邊長(zhǎng)出許多細(xì)小的圓形細(xì)胞。增加誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度后，圓形細(xì)胞逐步增多，體積增大，并聚集成團(tuán)。誘導(dǎo)第5d出現(xiàn)雙硫腙(DTZ)染色陽(yáng)性細(xì)胞。誘導(dǎo)第6d，DTZ陽(yáng)性細(xì)胞增多。作胰島素免疫組化染色檢查，聚集成團(tuán)的細(xì)胞呈胰島素染色陽(yáng)性。由于IPC中的胰島素和Zn2+結(jié)合形成結(jié)晶，貯存于β顆粒中。DTZ能和Zn2+結(jié)合，使含Zn2+的細(xì)胞顯棕紅色。因此，DTZ染色被認(rèn)為是胰島β細(xì)胞的特異性染色方法。在IPC培養(yǎng)基中誘導(dǎo)6d的細(xì)胞團(tuán)具有胰島

10、β細(xì)胞的染體特征，經(jīng)胰島素免疫組化染色進(jìn)一步證明這些細(xì)胞具有胰島素合成功能。 與文獻(xiàn)報(bào)道的28d-32d的IPC誘導(dǎo)時(shí)間相比，我們的誘導(dǎo)方案共用18d，誘導(dǎo)時(shí)間顯著縮短。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步改進(jìn)了誘導(dǎo)方法，不經(jīng)過(guò)NPC階段的誘導(dǎo)，將擴(kuò)增后的ES細(xì)胞直接進(jìn)行IPC誘導(dǎo)。結(jié)果共經(jīng)歷14d誘導(dǎo)培養(yǎng)，也得到了與多階段誘導(dǎo)結(jié)果類(lèi)似的IPC，誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)一步縮短。改良誘導(dǎo)法不僅縮短了時(shí)間，簡(jiǎn)化了誘導(dǎo)方法，也證明NPC階段不是ES細(xì)胞向IPC

11、分化的必經(jīng)階段。 4、為了進(jìn)行胰島素分泌細(xì)胞的移植治療，我們采用鏈脲霉素(STZ)腹腔注射制備了糖尿病小鼠模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，STZ用80mg/Kg分2次，間隔3d給藥，比100mg/Kg一次給藥制備的糖尿病模型更適合用于細(xì)胞移植治療研究。經(jīng)多次測(cè)定空腹血糖和體重，確認(rèn)模型制備成功。選擇血糖穩(wěn)定于13mmol/L-25mmol/L的糖尿病小鼠為IPC移植治療的觀察對(duì)象。將IPC消化后用hochest33342標(biāo)記后給糖尿病小鼠進(jìn)行移

12、植。每只小鼠移植1×106IPC于肝臟或皮下，用環(huán)孢素A預(yù)防移植排斥。結(jié)果肝臟內(nèi)移植者移植一周后血糖下降，但未恢復(fù)正常。移植后12d取肝臟進(jìn)行病理切片檢查，未發(fā)現(xiàn)有標(biāo)記的移植細(xì)胞。皮下移植者移植一周后血糖完全恢復(fù)正常。12d后取移植部位組織檢查，發(fā)現(xiàn)有大量移植細(xì)胞存在。移植細(xì)胞大多數(shù)成團(tuán)塊狀生長(zhǎng)，和周?chē)窘M織有明顯界。也有的移植細(xì)胞散在分布于脂肪組織中。經(jīng)胰島素免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞呈胰島素染色陽(yáng)性。說(shuō)明移植的IPC在受者體內(nèi)存活

13、增殖并分泌胰島素，使糖尿病小鼠的血糖恢復(fù)正常。 雖然我們改進(jìn)了IPC的誘導(dǎo)條件，縮短了IPC的誘導(dǎo)時(shí)間，將IPC用于糖尿病小鼠的實(shí)驗(yàn)治療取得初步療效；構(gòu)建了pdx-1基因的表達(dá)載體，并在ES細(xì)胞內(nèi)獲得了短暫表達(dá)，為糖尿病的細(xì)胞移植治療打下了一定的基礎(chǔ)，但未能獲得構(gòu)成性表達(dá)pdx-1的ES細(xì)胞系，因而未能觀察到外源性pdx-1過(guò)表達(dá)對(duì)ES細(xì)胞向IPC分化的影響，也未能進(jìn)行IPC移植治療的大批量、長(zhǎng)時(shí)間觀察，今后應(yīng)繼續(xù)這方面的工作，