超聲波介導(dǎo)質(zhì)粒pUC19轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法及機(jī)制的研究.pdf

1、微生物生物轉(zhuǎn)化（Biological Transformation）是指受體菌接受來(lái)自供體菌的DNA片段，通過(guò)交換整合到自己的基因組中，從而獲得部分新的遺傳性狀的現(xiàn)象。目前，對(duì)于轉(zhuǎn)化方法的研究已基于成熟，已應(yīng)用于科研的轉(zhuǎn)化方法有化學(xué)轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法、聲孔轉(zhuǎn)化法等。但對(duì)于轉(zhuǎn)化發(fā)生機(jī)制的研究還無(wú)系統(tǒng)的概述，這不僅涉及外源DNA分子的性質(zhì)，更與受體菌的性質(zhì)息息相關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)利用超聲波介導(dǎo)質(zhì)粒 pUC19轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E

2、scherichia coli。E.coli)DH5α。通過(guò)對(duì)超聲波介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞模型的建立、E. coli DH5α細(xì)胞壁成分肽聚糖與金屬離子間的吸附關(guān)系、超聲波處理前后E. coli DH5α細(xì)胞膜通透性的變化、生物大分子物質(zhì)含量的變化以及E. coli DH5α細(xì)胞外膜蛋白mrdB基因突變株的構(gòu)建方面進(jìn)行研究，以期揭示轉(zhuǎn)化發(fā)生的機(jī)制。
　　研究結(jié)果表明，在二價(jià)金屬離子環(huán)境中，適宜條件的超聲波可介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)

3、入宿主細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)E. coli DH5α菌液OD600=0.4~0.6，超聲功率為40 W時(shí)，在35℃下處理E. coli DH5α和質(zhì)粒pUC19的混合液25 s，質(zhì)粒pUC19轉(zhuǎn)化E. coli DH5α細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率最大可以達(dá)到1.006×107 CFU/μg DNA。對(duì)超聲波處理前后E. coli DH5α細(xì)胞膜通透性的變化研究結(jié)果顯示，在最佳轉(zhuǎn)化條件下細(xì)胞膜通透性的變化是未經(jīng)超聲波處理的細(xì)胞膜通透性的10倍，然而不同超

4、聲波條件下的轉(zhuǎn)化效率的變化與細(xì)胞膜通透性的變化不成正比，也與E. coli DH5α細(xì)胞存活率的變化不成正比，這是因?yàn)樵谧罴艳D(zhuǎn)化條件菌液OD600值為0.4~0.6、超聲波功率為40 W、在溫度為35℃下處理25 s，超聲波作用對(duì)質(zhì)粒DNA的完整性沒有損傷，對(duì)宿主細(xì)胞的破壞也很小，但超出此范圍后，質(zhì)粒DNA的完整性受到破壞，同時(shí)宿主細(xì)胞由于其自身的調(diào)控與修復(fù)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率的不一致。E.coli DH5α細(xì)胞壁成分肽聚糖與金屬離子、DNA互作

5、結(jié)果顯示肽聚糖對(duì)金屬離子的吸附?jīng)]有專一性，無(wú)論是一價(jià)（Na+）金屬離子還是二價(jià)（Mg2+、Ca2+）金屬離子，肽聚糖均可與其發(fā)生吸附作用，但與DNA不能發(fā)生反應(yīng)，證明在轉(zhuǎn)化發(fā)生時(shí)必不可少的二價(jià)金屬離子（Ca2+）有一部分與細(xì)胞壁成分肽聚糖發(fā)生了反應(yīng)，為外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞提供了離子通道，但尚不能證明肽聚糖的存在決定轉(zhuǎn)化的發(fā)生。對(duì)超聲波處理前后宿主細(xì)胞E. coli DH5α中的生物大分子物質(zhì)檢測(cè)以及掃描電子顯微鏡與原子力顯微鏡觀察結(jié)果

6、顯示，超聲波產(chǎn)生的氣穴與聲穴效應(yīng)改變了宿主細(xì)胞的膜通透性、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)等，導(dǎo)致胞內(nèi)大分子物質(zhì)透過(guò)細(xì)胞膜向胞外溢出，致使超聲波處理后的細(xì)胞出現(xiàn)褶皺、形態(tài)不均等現(xiàn)象。這一現(xiàn)象為外源DNA的進(jìn)胞提供了外源動(dòng)力。本研究通過(guò)Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了E. coli DH5α外膜蛋白mrdB基因的突變株，但關(guān)于mrdB基因在E. coli DH5α生存與轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮的功能還需進(jìn)一步研究。
　　綜合以上所有結(jié)果可得出結(jié)論：宿主細(xì)胞內(nèi)外膜通透性的改變是外

7、源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的基礎(chǔ)條件；二價(jià)金屬離子與細(xì)胞壁成分肽聚糖的相互作用為外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)提供了離子通道；同一條件的超聲波處理下的轉(zhuǎn)化效率與宿主細(xì)胞生存率無(wú)直接關(guān)系；超聲波處理造成宿主細(xì)胞胞內(nèi)大分子物質(zhì)的外溢，這也為外源DNA的進(jìn)入提供了通道與基礎(chǔ)。本研究通過(guò)對(duì)E. coli DH5α細(xì)胞生理特性的研究已逐步摸索清楚決定轉(zhuǎn)化發(fā)生的相關(guān)基礎(chǔ)條件，同時(shí)構(gòu)建了E. coli DH5α外膜蛋白mrdB基因的突變株。相信隨著對(duì)分子生物學(xué)的