實驗四、五章大腸桿菌感受態(tài)的制備、質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選概述

1、實驗四、五大腸桿菌感受態(tài)的制備、質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選,一、實驗?zāi)康?掌握利用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)的原理；掌握質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選的原理；熟悉實驗的具體操作步驟，掌握無菌操作技術(shù)。,一、實驗原理,常用預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌制備感受態(tài)細(xì)胞：用低溫（0℃）低滲CaCl2溶液處理快速生長的細(xì)菌，即可獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基－鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過

2、熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對DNA的吸收。 在一定條件下，外源ＤＮＡ片段與感受態(tài)細(xì)胞混合、保溫和熱激，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞的ＤＮＡ分子通過復(fù)制、表達(dá)，實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子，即帶有異源ＤＮＡ分子的受體細(xì)胞。,二、實驗所需器材和試劑,（一）儀器設(shè)備： 恒溫?fù)u床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺式高速離心機(jī),無菌工作臺,低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機(jī), 分光光度計,

3、微量移液槍。,（二）試劑： 1.LB固體和液體培養(yǎng)基。 2.100mM CaCl2溶液。 3.待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。,三、實驗步驟,1.挑取一DH5α單菌落于20ml LB培養(yǎng)液中37℃過夜培養(yǎng) 。,2.取其中800ul菌液于一含20mlLB培養(yǎng)液的錐形瓶，37℃振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.4-0.6之間.,3.取1.5ml菌液置于離心管內(nèi)，4℃ 10000g離心1min，去掉上清。,4℃ 10000g離心1min,4.加入1ml

4、,100mM的冰冷CaCl2溶液，反復(fù)吸打混勻，使細(xì)胞重懸，然后冰浴30min.,1ml 、100mM的冰冷CaCl2,5.4℃ 10000g離心5分鐘收集細(xì)胞，然后瞬時離心并去掉殘液；最后，加100uL、100mM的冰冷CaCl2溶液，輕輕反復(fù)吸打懸浮細(xì)胞,冰上放置3-5min,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。,6.感受態(tài)細(xì)胞暫且不用時加入等V30%的甘油，貯存于-70℃可保存半年，取其中一份進(jìn)行轉(zhuǎn)化。,,加入等V30%甘油,7.向轉(zhuǎn)化管中加入1

5、uL質(zhì)粒DNA(不超過10uL),旋轉(zhuǎn)3-5圈混合，最后于冰上放置30min。,8.將上述混合物轉(zhuǎn)移到42℃的水浴鍋中，熱休克90s(不要搖動試管)，然后將試管迅速轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻1-2min。,9.向管內(nèi)加入800ul的LB培養(yǎng)液。然后37℃培養(yǎng)45min-1h。,10.取適量體積的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)抗生素的LB固體平板上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻。室溫放置15分鐘.,11. 倒置平板于37 ℃培養(yǎng)12－16個小時。,四、實驗注意

6、事項,為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素： 1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度: 細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。 3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。