雞致病性大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建及其免疫原性的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、雞大腸桿菌病是一種由大腸埃希氏菌為原發(fā)性或繼發(fā)性病原體所致雞的一類疾病的總稱。十二世紀(jì)中期以后,隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展,雞大腸桿菌病的危害日趨嚴(yán)重,特別是在雞的幾種重要病毒病得到有效控制后,由其造成的損失明顯上升,該病已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的主要細(xì)菌病之一。 本文分別對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的四株雞致病性大腸桿菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定以及藥敏實(shí)驗(yàn)、毒力實(shí)驗(yàn)的研究,又將此四株菌株按照適當(dāng)?shù)谋壤苽淞舜竽c桿菌多價(jià)滅活疫苗,所制菌苗產(chǎn)生免疫力較早,免疫

2、保護(hù)期較長(zhǎng),具有較好的免疫原性。然后,以這四株菌株為研究對(duì)象,根據(jù)GenBank公布的致病性雞大腸桿菌的I型菌毛pilA基因和外膜蛋白C基因序列,分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物,經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增出pilA基因和OmpC基因,序列分析表明擴(kuò)增得到的基因與其參考菌株序列高度同源。進(jìn)而,將擴(kuò)增得到的兩個(gè)基因分別定向克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中,得到兩個(gè)重組質(zhì)粒pETpilA和pETOmpC,轉(zhuǎn)化致受體大腸桿菌BL21(DE3)中,得到重組菌株BL

3、21(DE3)(pETpilA)和BL21(DE3)(pETOmpC),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,由SDS-PAGE分析分別可見(jiàn)表達(dá)的20Ku和40.9Ku的特異蛋白條帶;Westemblot檢測(cè)說(shuō)明表達(dá)的a毒素蛋白具有較好的反應(yīng)原性。又對(duì)已構(gòu)建的基因工程菌株BL21(DE3)(pET-pilA)和BL21(DE3)(pET-OmpC),分別從溫度、接菌量、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等方面進(jìn)行誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,結(jié)果顯示菌株BL21(DE3)

4、(pET-pilA)在40℃,接菌量80ul,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)2.5h,IPTG濃度為0.96mM,誘導(dǎo)時(shí)間6h時(shí)得到最大蛋白表達(dá)量,而菌株BL21(DE3)(pET-OmpC)的最佳誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)溫度37℃,接菌量60ul,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)2h,IPTG濃度為0.80mM,誘導(dǎo)時(shí)間5h。最后,將表達(dá)菌毛pilA蛋白和外膜蛋白C的菌株分別制成基因工程疫苗并進(jìn)行初步的免疫原性研究,免疫小鼠后,保護(hù)能力分別達(dá)80%和60%,混合疫苗的保護(hù)力尤佳,高達(dá)100

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