基于NK3R的抗腫瘤血管生成肽的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　血管生成是新生血管形成的基礎，近年來，有大量的研究表明，血管生成在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。因此，抗腫瘤血管生成研究是抗腫瘤治療領域中極有前景的一個重要方向。但是近年來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多個美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的血管生成抑制劑，特別是針對血管內皮細胞生長因子的單抗類藥物，在臨床前或臨床水平上表現(xiàn)出嚴重毒副作用。因此，尋找新靶點或新藥物分子對于抗腫瘤血管生成新策略的開發(fā)具有重要的意義。既往研究發(fā)現(xiàn)速激肽

2、受體家族的重要成員之一，神經激肽-3受體（NK3R），在機體內多種生理過程中起到重要作用，但對其在血管生成中的作用和機制仍然不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)，NK3R的高親和配體，內源性神經激肽B（NKB）可抑制血管生成，這表明靶向抑制 NK3R通路可有效阻斷新生血管生成。基于以上研究，本論文基于 NK3R激動劑[MePhe7]NKB，通過引入腫瘤靶向序列 NGR和CNGRC，分別構建了兩種類似物 NK3R-A1與 NK3R-A2。通過一系列體內外

3、實驗探索NK3R激動劑及其類似物的抗血管生成作用和抗腫瘤效應，通過聯(lián)合應用NK3R選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]研究NK3R激動劑及其類似物的作用機制。
　　研究目的：
　　本研究的主要目的是對本論文設計的兩種基于NK3R激動劑[MePhe7]NKB結構進行改造的NK3R激動劑類似物NK3R-A1和NK3R-A2在體內和體外分別進行抗血管生成作用及其機制的研究。
　　研究方法：
　　基于本實驗室前期工

4、作基礎，通過大量文獻查閱，本論文從NK3R激動劑[MePhe7]NKB出發(fā)，通過引入兩類腫瘤靶向序列，構建了結構改造的NK3R激動劑類似物NK3R-A1和NK3R-A2。通過Fmoc固相合成策略合成了NK3R激動劑及其類似物以及NK3R拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]，以反相高效液相色譜法進行純化，經質譜確認結構正確。然后通過明膠海綿-雞胚尿囊膜（ gelatin sponge-CAM）實驗對上述三種 NK3R激動劑及其類似物進行抗

5、血管生成作用的研究，并運用拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]進行相應的競爭性實驗，以驗證它們的作用機制；其次通過體外的 MTT細胞增殖實驗以及兩種經典的遷移實驗，對這三種 NK3R激動劑及其類似物進行體外的抗血管生成研究，同時利用[Gly6]NKB[3-10]進行相應的競爭性實驗探討其作用機制；另外，本研究還進行了體內小鼠移植瘤實驗模型和免疫組織化學（IHC）染色實驗對經過藥物處理的腫瘤組織進行結果分析。并最終對待測多肽類藥物的抑瘤效

6、果和抗腫瘤血管生成作用進行評估。
　　研究結果：
　　以Fmoc固相多肽合成方法合成了NK3R激動劑及其類似物[MePhe7]NKB（ Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2）、 NK3R-A1（ Asn-Gly-Arg-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2）、 NK3R-A2（ Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-

7、Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2）以及NK3R選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]（His-Asp-Phe-Gly-Val-Gly-Leu-Met-NH2），以反相高效液相色譜儀純化，質譜鑒定證明分子量正確。進一步的 gelatin sponge-CAM實驗結果表明，上述三種NK3R激動劑及其類似物都體現(xiàn)出了抗血管生成作用。用NK3R選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]預處理后，三種

8、多肽的抗血管生成作用均被抑制。
　　隨后進入體外研究，MTT細胞活性實驗結果顯示，三種被檢測多肽在24小時內對HUVECs的增殖沒有明顯的影響，但藥物作用大于24小時后，出現(xiàn)了一定的細胞殺傷作用，因此在后續(xù)的細胞遷移實驗中藥物處理時間限時在24小時之內。在細胞劃痕實驗中，50μM的[MePhe7]NKB、25μM的NK3R-A1和NK3R-A2在藥物作用24小時時體現(xiàn)了最好的抑制HUVECs遷移的效果。抑制率分別達到了20.0％、

9、73.2%以及53.7%；Transwell細胞遷移實驗中也得到了相似的實驗結果，陰性對照組的遷移細胞數(shù)目分別是5μM的[MePhe7]NKB、NK3R-A1與NK3R-A2的2.3倍、5.0倍和7.0倍，三種多肽都體現(xiàn)出了在體外很好的抑制HUVECs遷移的效果，證明了它們在體外的抗血管生成作用。值得注意的是，NK3R-A1與NK3R-A2在細胞遷移實驗中相較于[MePhe7]NKB，具有更好的抗血管生成作用。聯(lián)合應用拮抗劑[Gly6]

10、NKB[3-10]對HUVECs進行預處理后，三種多肽的抗血管生成作用被明顯抑制，證明其抗血管生成作用是通過NK3R通路介導的。細胞劃痕競爭性結合實驗中，NK3R-A1與NK3R-A2拮抗組的“愈合程度”分別達到了96.3%和97.6%，[MePhe7]NKB拮抗組的“愈合程度”幾乎達到和陰性對照組相同的水平，說明三種檢測多肽的抗血管生成作用幾乎被完全拮抗；Transwell細胞遷移競爭性結合實驗數(shù)據顯示，拮抗組的遷移細胞數(shù)目分別是[M

11、ePhe7]NKB、NK3R-A1與 NK3R-A2單獨處理組的3.9倍、2.8倍和3.3倍，依舊在一定程度上拮抗了NK3R激動劑及其類似物的抗血管生成作用。
　　而體內實驗結果顯示，和生理鹽水組相比，經過三種NK3R激動劑及其類似物高低劑量組處理后，瘤組織體積在給藥期間顯著減小，較陰性對照組瘤體積減小50%左右。第15天，小鼠脫頸處死，取出瘤組織進行稱重，發(fā)現(xiàn)所有的藥物處理組的瘤重均明顯小于生理鹽水組，其中以[MePhe7]NK

12、B的高劑量組和NK3R-A1的低劑量組表現(xiàn)出了更好的抑制效果，抑瘤率均達到了~60%。而IHC染色的結果也顯示出，藥物處理組的微血管密度（MVD）相比于陰性對照組有著明顯的減少。值得注意的是，NK3R-A1與NK3R-A2藥物處理組的MVD值相較于[MePhe7]NKB有所減少，說明了前兩者具有一定的抗腫瘤血管生成作用。
　　研究結論：
　　綜上所述，本論文通過對NK3R激動劑及其類似物[MePhe7]NKB、NK3R-A1