修飾的腫瘤抗原肽CEA-,610D-疫苗抗腫瘤作用的實驗研究.pdf

1、目的： 腫瘤抗原肽即TCR（T cell receptor，TCR）所識別的與MHC分子結(jié)合的8-12個氨基酸的短肽，為腫瘤抗原的重要組成成分，是誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是相對分子質(zhì)量為180KD的膜胞間黏附糖蛋白，作為最為重要的腫瘤相關(guān)抗原之一，主要表達在結(jié)腸、直腸、胃、胰腺腫瘤、70％以上的肺癌和50％左右的乳腺癌中，是一種高效且較為理想的靶抗原。目

2、前，選擇以CEA為靶點的腫瘤生物治療具有普遍的臨床意義。但研究表明，天然肽抗原CEA605-613屬自身抗原，免疫原性弱，易引起免疫耐受，臨床實驗未能觀察到足夠強度的特異性抗腫瘤應(yīng)答。因此，本研究選擇天然表位CEA605-613（YLSGANLNL）在6位上以天冬氨酸代替天冬酰氨，采用固相合成法合成新的修飾CEA抗原肽疫苗（CEA610D），提高抗原肽的免疫原性，增加肽與復合物的穩(wěn)定性，并通過體外誘導肽特異性細胞毒性T淋巴細胞（cyto

3、lytic T lymphocyte，CTL）產(chǎn)生特異性抗腫瘤應(yīng)答，評價其體外抗腫瘤免疫的有效性，且從分子及基因水平上闡明其激活免疫細胞和介導細胞毒作用的抗腫瘤機制，為疫苗的臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。 方法： 1．化學合成法合成CEA修飾肽（CEA610D）、天然肽和HLA-A2無關(guān)肽。 2．RT-PCR法篩選表達CEA、HLA-A2表型的人結(jié)腸癌腫瘤細胞株T84及表達CEA非HLA-A2表型的人結(jié)腸癌腫瘤細胞

4、株lovo；檢測活化的CTL細胞殺傷相關(guān)介質(zhì)穿孔素的表達水平。 3．MTT法檢測，絲裂霉素C（MMC）對HLA-A2人外周血單個核細胞（PBMC）的抑制作用；同種異體混合淋巴細胞的增殖反應(yīng)；肽誘導的CTL的增殖活性及對T84、lovo腫瘤細胞的特異靶向殺傷作用。 4．采用人同種異體單向混合淋巴細胞HLA-A2表型與肽共孵育的方法誘導特異性殺傷T細胞（CTL）。 5．流式細胞術(shù)觀察CTL細胞表面CD3、CD4、CD

5、8的表達變化。 6．ELISA法檢測CTL培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平。 結(jié)果： 1．采用多肽固相合成法合成天然肽CEA605-613序列為YLSGANLNL。對天然肽在原氨基酸610位點上以天冬氨酸替換天冬酰胺，合成修飾的CEA抗原肽CEA610D，序列為YLSGADLNL。合成無關(guān)肽MAGE-3，序列為LLIIVLAII。 2．25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml不同質(zhì)量濃度

6、的MMC，作用于HLA-A2人PBMC30分鐘后，對PBMC均有明顯的抑制作用（P<0．05）。 3．將25μg/ml、50μg/ml質(zhì)量濃度的MMC制備的HLA-A2人PBMC刺激細胞，與異體的外周血PBMC共培養(yǎng)48h，其中25μg/ml組增殖指數(shù)為1．34，混合淋巴細胞反應(yīng)增殖最為顯著（p<0．05）。 4．在混合淋巴細胞培養(yǎng)系中分別加入CEA610D、CEA天然肽及無關(guān)肽，并添加細胞因子rhIL-2，共孵育5d，

7、收獲三種肽特異性CTL細胞。其中CEA610D組的CTL細胞增殖較對照組相比最為顯著（p<0．05）。 5．CEA610D刺激的同種異體混合淋巴細胞誘導的表型為CD3+CD8+的CTL細胞所占比例為38．0％，與天然肽組及無關(guān)肽組的35．5％和36．1％相比，略有增高。 6．抗原肽特異性CTL對腫瘤細胞的靶向殺傷作用，在效靶比分別為10：1、20：1、40：1時，CEA610D組誘導的CTL對高表達CEA的HLA-A2結(jié)

8、腸癌細胞T84的殺傷活性最強，分別是（36．1±3．57）％、（47．1±1．86）％和（56．7％±3．73），顯著高于無關(guān)肽組（P<0．01）；而對非HLA-A2的高分泌CEA的lovo結(jié)腸癌細胞的殺傷活性維持在較低的水平，分別為（19．4±0．99）％、（23．7±0．50）％和（26．5±3．54）％。表明修飾的肽疫苗能夠有效誘導特異性CTL細胞，并且殺傷作用是HLA-A2限制性的針對CEA的特異殺傷。 7．CEA610

9、D組CTL細胞殺傷相關(guān)介質(zhì)穿孔素mRNA表達水平呈高表達，其相對定量值為0．58，顯著高于天然肽組的0．50及無關(guān)肽組的0．42。 8．CEA610D組所誘導的肽特異性CTL細胞上清IFN-γ分泌水平為（1399．80±11．86）pg/ml，明顯高于無關(guān)肽組（P<0．01）。 結(jié)論： 1．修飾的CEA610D抗原肽與天然肽疫苗相比，可提高免疫原性；與無關(guān)肽疫苗相比，可打破免疫耐受，具有顯著增強和激活特異性CTL

10、增殖、分化的能力，提高細胞誘導體系中CD3+CD8+CTL細胞的比率。 2．修飾的CEA610D抗原肽疫苗誘導產(chǎn)生的CTL細胞，特異性殺傷高表達CEA且為HLA-A2限制性的T84結(jié)腸癌細胞，而對高表達CEA且非HLA-A2限制性的lovo腫瘤株殺傷作用較弱，提示其抗腫瘤作用為HLA-A2限制性的針對CEA的特異性殺傷。 3．修飾的CEA610D抗原肽疫苗誘導產(chǎn)生的CTL細胞殺傷活性顯著增強的機制，可能與上調(diào)釋放殺傷介質(zhì)