灰色鏈霉菌S106內(nèi)肽酶基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、運(yùn)用雙層平板從土壤中篩選得到兩株能溶解金黃色葡萄球菌和變形鏈球菌的鏈霉菌，一株為球孢鏈霉菌S186，一株為灰色鏈霉菌S106，并已從S106基因組中克隆得到N，O-二乙酰胞壁質(zhì)酶的成熟肽基因。根據(jù)作用于肽聚糖上不同的位點(diǎn)，溶菌酶可以分為胞壁質(zhì)酶，內(nèi)肽酶，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰酰胺酶等。胞壁質(zhì)酶，內(nèi)肽酶，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰酰胺酶不僅可以裂解金黃色葡萄球菌和變形鏈球菌，而且在微生物細(xì)胞壁的生長及分裂中起重要作用。所以，擬從S10

2、6基因組中克隆出內(nèi)肽酶或酰胺酶的基因并進(jìn)行原核表達(dá)及酶性質(zhì)研究。 從NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，搜索得到了鏈霉菌內(nèi)肽酶和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的序列，運(yùn)用Clustw進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合CDD數(shù)據(jù)庫，選擇合適的保守區(qū)，在線設(shè)計(jì)CODEHOP引物，運(yùn)用CODEHOP PCR技術(shù)從鏈霉菌S186和S106的基因組中克隆出了內(nèi)肽酶和酰胺酶的部分基因片段，將擴(kuò)增得到的片段連接至pUcm-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選轉(zhuǎn)化子，并

3、進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，克隆得到的序列與鏈霉菌的內(nèi)肽酶和酰胺酶序列有很高的同源性。 根據(jù)CODEHOP擴(kuò)增得到的基因片段設(shè)計(jì)嵌套引物，運(yùn)用TAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增出了S106中內(nèi)肽酶保守區(qū)的5’端和3’的序列，拼接得到了內(nèi)肽酶基因pR4的全長基因，分析結(jié)果表明，pR4酶基因全長711bp，編碼237個(gè)氨基酸，為肽酶23/37家族成員，與天藍(lán)色鏈霉菌中的一個(gè)肽酶基因的相似性達(dá)69﹪，并運(yùn)用生物學(xué)軟件分析了基本的酶學(xué)性質(zhì)和信號(hào)肽序列

4、，結(jié)果顯示，pR4酶為一個(gè)典型的分泌型蛋白，信號(hào)肽長39個(gè)氨基酸，成熟肽197個(gè)氨基酸，分子量為19971.10Da，等電點(diǎn)為9.57，并將成熟肽命名為R4基因，另外還對(duì)包括pR4在內(nèi)的50個(gè)物種肽酶進(jìn)行了氨基酸序列的比較，分析了pR4基因在內(nèi)肽酶系中的進(jìn)化地位。 設(shè)計(jì)引物自S106的基因組擴(kuò)增得到R4基因，并通過合適的酶切位點(diǎn)將R4基因連接至表達(dá)載體pET-26b(+)，構(gòu)建了pET-26b(+)-R4重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.co

5、liBL21(DE3)plySs，通過菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證，得到了轉(zhuǎn)內(nèi)肽酶R4基因的工程菌，重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后大量表達(dá)重組的內(nèi)肽酶，對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行了SDS-PAGE分析和酶活性分析。結(jié)果顯示，內(nèi)肽酶的溶菌活性較低，但這可能一方面使由于內(nèi)肽酶本身的溶菌活性就很低，另一方面可能是由于沒有找到合適的底物和反應(yīng)條件所致。 此外還對(duì)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究過的R2基因的上游調(diào)控序列進(jìn)行了初步研究，運(yùn)用TAIL-PCR技術(shù)克隆得到了一段序列，該段