鏈霉菌麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶基因的克隆、原核表達及其產(chǎn)酶研究.pdf

1、環(huán)狀糊精是淀粉經(jīng)酶降解環(huán)化而成的具有筒狀疏水內(nèi)腔的產(chǎn)物,合成大環(huán)糊精的酶有麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶。由于其在生物體內(nèi)的含量很低,無論作為研究來源還是用于制備大環(huán)糊精,都不能滿足實際需求。本文從Streptomyces ssp.ST66中擴增到麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶(Mal Q)基因,構(gòu)建了一株基因工程菌E.coli BL21/pET-GST-Mal Q,并成功得到表達。對表達產(chǎn)物進行了初步分離純化,并催化直鏈淀粉合成大環(huán)糊精。研究了影響基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶

2、相關因素,主要結(jié)論如下:
　　 (1)用PCR方法擴增Streptomyces ssp.ST66 Mal Q基因,將該基因插入原核表達載體pET-GST中,測序后發(fā)現(xiàn)開放閱讀框(ORF)全長2133 bp,編碼711個氨基酸,分子量為76.56 kDa。在GenBank中經(jīng)BLAST比對,與報道的Streptomyces coelicolor Mal Q基因同源性高達97％。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21,構(gòu)建基因工程菌E.

3、coli BL21/pET-GST-Mal Q,經(jīng)IPTG誘導表達目的蛋白。離心收集離心收集并利用超聲波破碎細胞,將細胞破碎液進行SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明Mal Q基因成功得到表達,且表達產(chǎn)物屬于胞內(nèi)酶；將粗酶液作用于麥芽二糖,反應液經(jīng)薄層色譜分析,證實粗酶液具有麥芽糖轉(zhuǎn)糖基活性。
　　 (2)通過親和色譜,純化得到目標蛋白。使用人鼻病毒14亞型3C蛋白酶切割融合蛋白,SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白在約76 kDa處有一

4、明顯條帶。以粗酶液處理直鏈淀粉,并采用淀粉酶水解上述反應液,發(fā)現(xiàn)反應液中含有較高的抗葡萄糖淀粉酶水解的淀粉。經(jīng)TLC檢測,證實了誘導表達的粗酶液能夠催化直鏈淀粉環(huán)化成大環(huán)糊精。
　　 (3)優(yōu)化了E.coli BL21/pET-GST-Mal Q的產(chǎn)酶工藝條件。最佳誘導條件為誘導時間5 hr,誘導溫度35℃,初始細胞量(OD6000.8),誘導劑IPTG終濃度0.9 mmol/L,轉(zhuǎn)速150 rpm。在最佳誘導條件下,基因工程菌