豬圓環(huán)病毒缺失突變體的構(gòu)建及Cap蛋白的真核細(xì)胞重組表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒2(PCV2)不僅引發(fā)豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病，還能與多種病原協(xié)同感染。PCV2感染相關(guān)的疾病有豬繁殖與呼吸道疾病綜合癥(PRRSV)、皮炎與腎病綜合癥(PDNS)、小腸炎、肺炎、仔豬先天性震顫等(CT)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。最近，PCV2感染豬群率不斷上升，為了弄清病毒基因功能和特性，研制開發(fā)有效的基因工程疫苗或亞單位疫苗，本實(shí)驗(yàn)對(duì)PCV2的ORF2基因進(jìn)行點(diǎn)缺失突變研究，并在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組Cap蛋白。

2、>　　 以PCV2-HZ0201毒株為模板，采用DpnⅠ定點(diǎn)突變技術(shù)缺失，構(gòu)建一系列ORF2基因編碼區(qū)的單核苷酸突變體轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，拯救病毒，結(jié)果表明，1057位點(diǎn)缺失的病毒拯救成功，拯救病毒毒價(jià)為10-5.32/0.1 mL，幾乎和HZ0201毒株相等。而1375-1381、1503及1525位點(diǎn)的單核苷酸缺失突變體不能拯救出病毒，這些結(jié)果表明以上位點(diǎn)的核苷酸是PCV2復(fù)制必須的，而1057位點(diǎn)的核苷酸是PCV2復(fù)制非必須的。

3、
　　 通過PCR擴(kuò)增PCV2的ORF2基因，插入轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTB，然后在Tn7轉(zhuǎn)座子的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)座，通過藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒鑒定，構(gòu)建出重組桿狀病毒載體Bacmid-ORF2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，經(jīng)IFA和Western blotting檢測(cè)表明，Sf9細(xì)胞表達(dá)的Cap蛋白能與抗PCV2 Cap單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為30KD。電鏡下觀察顯示，Sf9細(xì)胞表達(dá)的Cap蛋白可形成病毒樣顆粒。