替加環(huán)素與5種抗生素對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的體外聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumanii，ABA)是一種革蘭陰性桿菌。普遍分布于自然界水及泥土、病院及人體皮膚表面、呼吸道、消化道和泌尿生殖道。鮑曼不動(dòng)桿菌作為一種條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力低下或免疫功能缺陷時(shí)會(huì)引起感染。鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，往往出現(xiàn)多重耐藥菌株或泛耐藥株。使得臨床醫(yī)生在治療時(shí)，往往在選擇藥物時(shí)不知所措，成為臨床治療的一大難題。隨著醫(yī)療水平的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的抗生素被大量的應(yīng)用于臨床，

2、這也使得鮑曼不動(dòng)桿菌在近年也成為醫(yī)院性感染致病菌中較為常見(jiàn)的一種細(xì)菌。通過(guò)比較2005-2014年的CHINET不動(dòng)桿菌屬耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)不同地區(qū)19家醫(yī)院2005年從臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌為2016株，而這一數(shù)字在2013年達(dá)到頂峰9024株。而且鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)各種抗生素的敏感性也逐年減低，根據(jù)CHINET數(shù)據(jù)，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦和米諾環(huán)素的耐藥率相對(duì)較低，分別為31.9-51.1％和5.4％-41.2％，其次為阿

3、米卡星（43.7％-64.1％），亞胺培南（31.7％-65.8％），而對(duì)其他的抗菌藥物的耐藥率均達(dá)到50％以上。而且最近5年有明顯上升的趨勢(shì)，如頭孢哌酮-舒巴坦就從2007年的5.4％猛增至2014年的39.6％，而亞胺培南的耐藥率也從2007年的37.7％上升至2014年的65.8％。而且多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multidrug-resistant A.baumannii)和泛耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌(extremely-drug res

4、istant A.baumannii)占比也是逐年增加，2014年基本都達(dá)到了45％以上?；颊叻植糏CU患者分離出的鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率較高，一般均在75％以上。這可能與ICU的患者免疫力較差，且長(zhǎng)期大量使用廣譜抗生素有關(guān)。因此也有學(xué)者將多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌形象地成為21世紀(jì)革蘭陰性桿菌中的“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌”(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)。
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5、2年的《中國(guó)鮑曼不動(dòng)桿菌感染診治與防控專(zhuān)家共識(shí)》中提出對(duì)于泛耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的治療提倡聯(lián)合用藥。目前臨床常用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌的抗生素有多粘菌素，替加環(huán)素、亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、甚至三、四代頭孢等。碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥率逐年增加，目前有專(zhuān)家建議加大其劑量使其在血藥濃度高于MIC的時(shí)間延長(zhǎng)以到達(dá)殺菌效果，但是目前缺乏大規(guī)模臨床實(shí)踐研究。
　　替加環(huán)素為甘氨酰環(huán)素類(lèi)抗菌藥物的第一個(gè)品種，對(duì)多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌有著較高的敏感

6、性。由于其在人體組織分布廣泛，因此血藥濃度、腦脊液藥物濃度較低，需與其他抗菌藥物聯(lián)用較好。目前替加環(huán)素在國(guó)內(nèi)上市時(shí)間較短，缺乏較多的臨床試驗(yàn)和體外藥敏實(shí)驗(yàn)研究。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的敏感性的報(bào)道差異較大，這可能與地域、用藥劑量等有一定關(guān)系。而且臨床常用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌的抗生素的研究種類(lèi)較少如三、四代頭孢，氟喹諾酮類(lèi)藥物和氨基糖苷類(lèi)藥物等。隨著替加環(huán)素的耐藥率有逐年上升的趨勢(shì)，聯(lián)合用藥勢(shì)在必行。因此本實(shí)驗(yàn)用替加環(huán)素與亞胺培

7、南、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素這5種臨床常用于鮑曼不動(dòng)桿菌治療的抗生素單藥及兩藥聯(lián)用的體外活性藥敏實(shí)驗(yàn)的研究，以期發(fā)現(xiàn)較好的聯(lián)合用藥方案，為臨床合理使用抗生素提供用藥參考。
　　研究方法:
　　1.菌株
　　實(shí)驗(yàn)所用的鮑曼不動(dòng)桿菌均來(lái)自2015年3月到2016年10月遼寧省人民醫(yī)院微生物室從臨床分離出的鮑曼不動(dòng)桿菌260株，經(jīng)PHONIX、VITECK鑒定，同時(shí)經(jīng)過(guò)紙片擴(kuò)散法測(cè)試，將對(duì)3個(gè)及以上種

8、類(lèi)抗生素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌列入實(shí)驗(yàn)菌株，共計(jì)50株
　　2.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株
　　ATCC35218，ATCC25922，均由遼寧省人民醫(yī)院微生物室提供。
　　3.抗菌藥物
　　(1)哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素的藥敏紙片均購(gòu)自O(shè)xoid賽默飛世爾科技有限公司。(2)注射用替加環(huán)

9、素:購(gòu)自輝瑞制藥有限公司(3)硫酸慶大霉素注射液:購(gòu)自河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司(4)注射用頭孢曲松鈉:購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司(5)鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液:購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司(6)注射用頭孢哌酮舒巴坦鈉:購(gòu)自輝瑞制藥有限公司。(7)注射用亞胺培南西司他丁鈉:購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司。
　　4.實(shí)驗(yàn)方法
　　選取臨床標(biāo)本分離出的細(xì)菌，經(jīng)哥倫比亞血平板或麥康凱平板18-24小時(shí)培養(yǎng)后，經(jīng)Vitek2 compact

10、全自動(dòng)分析儀來(lái)鑒定，確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌后放入脫脂牛奶中于-80℃冰箱中保存。將已經(jīng)鑒定的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株從冰箱中取出并接種在一次性哥倫比亞血平板上并放入5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)。挑取培養(yǎng)后18-24h的純培養(yǎng)菌落4-5個(gè)。制備成菌懸液。將配好的菌懸液放入比濁儀中，調(diào)整濃度，使其最終達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?。用無(wú)菌棉簽蘸取校正過(guò)的菌懸液，在試管壁上擠壓幾回，壓去多余的菌液，涂布整個(gè)MH培養(yǎng)基表面。涂布菌液的平板于室溫3-5m

11、in后，用紙片分配器，將抗生素藥片貼于平板表面，放置于5％的CO2培養(yǎng)箱中18-24小時(shí)后，將對(duì)青霉素類(lèi)，頭孢類(lèi)，碳青霉烯類(lèi)，氟喹諾酮類(lèi)，氨基糖苷類(lèi)，四環(huán)素類(lèi)中的3類(lèi)抗生素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌劃歸為多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌。
　　選取已經(jīng)判定為多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌50株，將其接種于一次性哥倫比亞血平板上，放置于37℃的CO2孵箱中孵育24小時(shí)后取出，并用無(wú)菌棉簽從哥倫比亞血平板上挑取菌落2-3個(gè)，在試管與液面接觸處細(xì)細(xì)研磨，使菌落完

12、溶于生理鹽水中，再使用比濁儀校正濁度至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋藭r(shí)的細(xì)菌數(shù)為108CFU/ml。再進(jìn)行100倍稀釋至106CFU/ml。
　　從-80℃冰箱中取出已經(jīng)配置好的抗生素各一支，待其室溫溶解后將其置于振蕩器混勻，并配置成相應(yīng)濃度的抗生素應(yīng)用液，無(wú)菌操作將事先倍比稀釋好的不同濃度的抗生素藥物溶液分別加入已經(jīng)滅菌的96孔聚苯乙烯板的各自相對(duì)應(yīng)的孔中，其中第1孔至第11孔加入抗生素，每孔100μl，第12孔加入100μl的肉湯，作為生

13、長(zhǎng)對(duì)照。將已經(jīng)稀釋好的濃度為106CFU/ml的菌懸液加入第1孔至第12孔中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)菌株為一排，使得最終的每孔細(xì)菌數(shù)為5×105CFU/ml.此時(shí)，每孔中含200μl的實(shí)驗(yàn)液體，抗生素與菌懸液各100μl。將加好的96孔聚苯乙烯板放入37℃的孵育箱中孵育18-24后觀察結(jié)果，每行以肉眼可見(jiàn)的不生長(zhǎng)鮑曼不動(dòng)桿菌的實(shí)驗(yàn)孔的抗生素濃度作為該抗生素的最小抑菌濃度值，并分別記錄。
　　根據(jù)之前測(cè)定好的單藥MIC值，選擇聯(lián)合用藥的藥物濃度，

14、以單藥MIC為中位數(shù)，各向上和向下延展稀釋度。一般選擇8個(gè)以上的稀釋濃度。配置抗生素的方法如單藥MIC測(cè)定時(shí)的方法?？v向(A-H)加入替加環(huán)素的降梯度方向，根據(jù)抗生素的不同，橫向（1-12）分別加入5種與替加環(huán)素聯(lián)合的抗生素。每孔分別加入2種聯(lián)合用藥的抗生素各50μ l后再加入濃度為5×105CFU/ml的菌懸液100μl，震蕩混勻后，將96孔板放入孵育箱中，培養(yǎng)18-24小時(shí)后觀察5種抗生素與替加環(huán)素兩兩應(yīng)用后的MIC替加環(huán)素和MIC

15、5種抗生素。
　　FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用。FIC指數(shù)判讀標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)FIC指數(shù)小于0.5時(shí)，兩種抗生素為協(xié)同作用;當(dāng)FIC指數(shù)為0.5-1時(shí)，兩種抗生素為相加作用;當(dāng)FIC指數(shù)大于1且小于2時(shí)，兩種抗生素為無(wú)關(guān)作用;當(dāng)FIC指數(shù)大于2時(shí)，兩種抗生素為拮抗作用。
　　結(jié)果:1、經(jīng)過(guò)紙片擴(kuò)散法復(fù)核后，多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出率為86.2％。(50/58)。2、50株鮑曼不動(dòng)菌對(duì)

16、14種臨床常用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌的抗生素耐藥性都達(dá)到了80％以上，敏感性中對(duì)阿米卡星(14％)、復(fù)方新諾明(14％)、四環(huán)素(14％)、亞胺培南(12％)敏感性較高，但也不甚理想、耐藥性中，頭孢哌酮-舒巴坦(80％)，阿米卡星(84％)、復(fù)方新諾明(84％)相對(duì)較好，頭孢哌酮-舒巴坦中介率最高(18％)。3、替加環(huán)素、亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、左氧氟沙星、頭孢曲松單獨(dú)使用的MIC90分別為1μg/ml、256μ g/ml、256μ g/

17、ml、128μ g/ml、2048μ g/ml，當(dāng)與替加環(huán)素分別聯(lián)合應(yīng)用后MIC90降為0.25μ g/ml、64μ g/ml、128μ g/ml、64μ g/ml、1024μ g/ml。這4種抗生素均對(duì)替加環(huán)素表現(xiàn)出比較好的協(xié)同和相加作用。慶大霉素在與替加環(huán)素聯(lián)合使用后替加環(huán)素和慶大霉素的MIC由單獨(dú)使用的1μg/ml和2048μg/ml上升至2μg/ml和4096μg/ml，顯示出拮抗的作用。
　　結(jié)論:1、替加環(huán)素與亞胺培南