多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素B的耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的：檢測(cè)臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌中攜帶的β-內(nèi)酰胺酶基因及外排泵基因，體外誘導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素B產(chǎn)生耐藥，以探討其對(duì)多粘菌素B的耐藥機(jī)制。
　　方法：1、連續(xù)收集西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床分離的63株非重復(fù)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、多粘菌素B及頭孢哌酮舒巴坦的最低抑菌濃度(MICs)。2、采用腸桿菌科基因間重復(fù)序列-聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-

2、PCR)獲得63株鮑曼不動(dòng)桿菌的指紋圖譜并進(jìn)行同源性分析。3、采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因TEM、AmpC、OXA-23、KPC、IMP、VIM，外排泵基因adeB、adeG、adeJ、adeR、adeS，兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因pmrA、pmrB。4、采用體外實(shí)驗(yàn)對(duì)收集的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥，以獲得多粘菌素B耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌。5、采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)誘導(dǎo)耐藥菌株及原始敏感菌株的外排泵基因

3、adeB、adeJ、adeG及兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因pmrA、pmrB的mRNA表達(dá)情況，分析其表達(dá)差異。6、對(duì)負(fù)責(zé)脂質(zhì)A生物合成的基因IpxA/lpxC/lpxD及兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因pmrA、pmrB進(jìn)行PCR擴(kuò)增并將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，探討耐藥菌株是否發(fā)生特異性突變。7.采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對(duì)誘導(dǎo)耐藥的菌株及原始敏感菌株進(jìn)行檢測(cè)，分析其蛋白質(zhì)差異。
　　結(jié)果：1、63株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素B

4、全部敏感，對(duì)亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星及阿米卡星的耐藥率為100％，對(duì)頭孢他啶的耐藥率為92％，對(duì)頭孢吡肟的耐藥率為97％，對(duì)頭孢哌酮舒巴坦的耐藥率為43％。2、63株鮑曼不動(dòng)桿菌經(jīng)過(guò)ERIC-PCR檢測(cè)共分為5型，主要為A型58株（A1型26株，A2型32株）、B型2株，C、D、E各為1株，主要來(lái)自于ICU及呼吸內(nèi)科。3、在臨床分離的63株鮑曼不動(dòng)桿菌中，有50株產(chǎn)TEM型β-內(nèi)酰胺酶，58株產(chǎn)AnpC酶，62株產(chǎn)OXA-23型碳青

5、霉烯酶，未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)KPC、IMP、VIM的菌株。此外63株鮑曼不動(dòng)桿菌中攜帶外排泵基因adeB、adeJ、adeG、adeR、adeS的分別為61、62、62、60、60株，攜帶pmrA、pmrB基因的分別為61及59株。4、對(duì)33株多粘菌素B敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)，共獲得了18株多粘菌素B耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，其對(duì)多粘菌素B的MIC值從0.5g/ml上升到256g/ml，而其他抗生素的MIC值均未發(fā)生明顯改變。5、通過(guò)RT

6、-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)耐藥菌株與原始敏感菌株之間外排泵基因adeB、adeG、adeJ的mRNA表達(dá)量并無(wú)明顯差異（P值分別為0.586、0.983、0.948），兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因PmrA在耐藥菌株存在高表達(dá)(p=0.014)，而PmrB基因在耐藥菌株與敏感菌株中表達(dá)無(wú)明顯差異(p=0.472)。6、對(duì)脂質(zhì)A生物合成的基因lpxA/lpxC/lpxD測(cè)序發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株的脂質(zhì)A合成基因lpxC在2649454位堿基發(fā)生突變(GAA→AA

7、A)，導(dǎo)致編碼的谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?，而兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因則未發(fā)現(xiàn)特異性突變。7、通過(guò)對(duì)多粘菌素B耐藥菌株及敏感菌株進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株在5177Da與6093Da出現(xiàn)特異的峰值增強(qiáng)現(xiàn)象，而在8049Da處則出現(xiàn)特異的峰值減弱。
　　結(jié)論：1、鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗生素有較高的耐藥率，對(duì)于多粘菌素B則全部敏感。2、鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥與產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶及外排泵的表達(dá)有關(guān)。3、通過(guò)體外誘導(dǎo)的方法能夠