HBx基因轉染SUDHL-4細胞對其生長侵襲的影響.pdf

1、背景和目的：
　　惡性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是淋巴造血系統(tǒng)的腫瘤，按照病理類型分為霍奇金淋巴瘤（Hodgkin disease，HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）。在中國，每年新發(fā)惡性腫瘤中淋巴瘤約占4％，是九種常見腫瘤中的一種，其在腫瘤導致的死亡排名中居列第十位，其中又以非霍奇金淋巴瘤為主，占 ML的85%～90%。彌漫性大 B細胞淋巴瘤（Diffuse la

2、rge B-cell lymphoma，DLBCL）在組織學形態(tài)、遺傳學特征、免疫表型及臨床表現上都存在著高度的異質性，是NHL中最為常見的一類組織學亞型。臨床上發(fā)現許多惡性淋巴瘤患者伴有乙型肝炎病毒的感染，兩者的關系日益受到相關研究人員的關注。大量臨床的研究數據也進一步表明NHL患者乙型肝炎病毒（HBV）感染率明顯高于普通人群及其他相關性實體腫瘤的患者，惡性淋巴瘤合并HBV的感染率僅次于肝癌；同時HBV的再激活在NHL合并HBV感染患

3、者的治療中表現顯著，這些研究和發(fā)現充分表明HBV病毒感染與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展存在著一定的相關性。
　　乙型肝炎病毒（HBV）具有S、C、P以及X區(qū)4個重疊開放讀碼框架（ORF），HBV的X基因作為其中最小的ORF，能夠編碼145個氨基酸組成的蛋白，即HBx。HBx可通過多種不同的作用誘導肝細胞癌（HCC）的形成，并促其發(fā)展，其中抑制肝細胞發(fā)生凋亡在 HBV導致 HCC發(fā)生的過程中起到巨大的作用。然而，目前的研究和相關報道尚不能解釋H

4、BV感染在NHL的發(fā)生和進展中的作用及具體機制。因此本實驗選用人彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）細胞株SUDHL-4作為研究對象，采用脂質體轉染的方法，將HBx基因轉入SUDHL-4細胞株中，建立帶有乙肝病毒的淋巴瘤細胞模型，研究HBx對B-NHL細胞生長侵襲轉移的影響并探討其可能的作用機制，為篩選有效的治療藥物開辟新的途徑，為淋巴瘤合并HBV感染的治療提供更多有力的理論依據。
　　方法：
　　1、利用分子克隆的方法構建H

5、Bx基因的真核載體pcDNA3.1-X。
　　2、將pcDNA3.1-X通過脂質體瞬時轉染轉入B-NHL細胞SUDHL-4中，構建整合有HBV X基因的淋巴瘤細胞株SUDHL-4-HBx，以SUDHL-4及轉染空載體的B-NHL細胞SUDHL-4-con作對照，利用CCK-8法檢測轉染96h內各組細胞的增殖情況，應用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡情況。
　　3、將pcDNA3.1-X通過脂質體轉染法轉入SUDHL-4后，用G4

6、18篩選穩(wěn)定轉染HBx的SUDHL-4細胞株，取對數期SUDHL-4、SUDHL-4-con和穩(wěn)定轉染的SUDHL-4-HBx細胞，利用CCK8法檢測三種細胞96h的生長情況；以SUDHL-4及轉染空載體的B-NHL細胞SUDHL-4-con作對照，應用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡情況，用改良噻唑藍法（MTT）檢測細胞粘附力；用Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。
　　結果：
　　1、重組質粒雙酶切結果及質粒測

7、序結果表明成功構建pcDNA3.1-X。
　　2、瞬時轉染后SUDHL-4細胞有HBx mRNA的表達，與SUDHL-4組細胞及SUDHL-4-con組細胞相比，SUDHL-4-HBx細胞的增殖減緩，G0/G1期細胞比例增加、S期細胞所占比例減少，細胞凋亡率增加。
　　3、穩(wěn)定轉染HBx基因的SUDHL-4細胞有HBx mRNA及HBx蛋白的表達，與SUDHL-4和SUDHL-4-con組細胞相比，SUDHL-4-HBx細胞

8、的增殖能力、粘附力及轉移侵襲能力有不同程度增強；細胞周期無顯著變化，細胞凋亡率顯著降低。
　　結論：
　　1、成功構建整合有HBV X基因和蛋白的B-NHL細胞株SUDHL-4-HBx。
　　2、瞬時轉染HBx基因后，SUDHL-4-HBx細胞的增殖減緩，細胞周期阻滯于G0/G1期，細胞凋亡率增加。
　　3、穩(wěn)定轉染HBx基因后，SUDHL-4-HBx細胞的增殖能力及粘附力、侵襲轉移能力均顯著增強；細胞凋亡率顯著