HBx基因轉(zhuǎn)染SUDHL-4細(xì)胞對(duì)其生長(zhǎng)侵襲的影響.pdf

1、背景和目的：
　　惡性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是淋巴造血系統(tǒng)的腫瘤，按照病理類(lèi)型分為霍奇金淋巴瘤（Hodgkin disease，HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）。在中國(guó)，每年新發(fā)惡性腫瘤中淋巴瘤約占4％，是九種常見(jiàn)腫瘤中的一種，其在腫瘤導(dǎo)致的死亡排名中居列第十位，其中又以非霍奇金淋巴瘤為主，占 ML的85%～90%。彌漫性大 B細(xì)胞淋巴瘤（Diffuse la

2、rge B-cell lymphoma，DLBCL）在組織學(xué)形態(tài)、遺傳學(xué)特征、免疫表型及臨床表現(xiàn)上都存在著高度的異質(zhì)性，是NHL中最為常見(jiàn)的一類(lèi)組織學(xué)亞型。臨床上發(fā)現(xiàn)許多惡性淋巴瘤患者伴有乙型肝炎病毒的感染，兩者的關(guān)系日益受到相關(guān)研究人員的關(guān)注。大量臨床的研究數(shù)據(jù)也進(jìn)一步表明NHL患者乙型肝炎病毒（HBV）感染率明顯高于普通人群及其他相關(guān)性實(shí)體腫瘤的患者，惡性淋巴瘤合并HBV的感染率僅次于肝癌；同時(shí)HBV的再激活在NHL合并HBV感染患

3、者的治療中表現(xiàn)顯著，這些研究和發(fā)現(xiàn)充分表明HBV病毒感染與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展存在著一定的相關(guān)性。
　　乙型肝炎病毒（HBV）具有S、C、P以及X區(qū)4個(gè)重疊開(kāi)放讀碼框架（ORF），HBV的X基因作為其中最小的ORF，能夠編碼145個(gè)氨基酸組成的蛋白，即HBx。HBx可通過(guò)多種不同的作用誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌（HCC）的形成，并促其發(fā)展，其中抑制肝細(xì)胞發(fā)生凋亡在 HBV導(dǎo)致 HCC發(fā)生的過(guò)程中起到巨大的作用。然而，目前的研究和相關(guān)報(bào)道尚不能解釋H

4、BV感染在NHL的發(fā)生和進(jìn)展中的作用及具體機(jī)制。因此本實(shí)驗(yàn)選用人彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）細(xì)胞株SUDHL-4作為研究對(duì)象，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將HBx基因轉(zhuǎn)入SUDHL-4細(xì)胞株中，建立帶有乙肝病毒的淋巴瘤細(xì)胞模型，研究HBx對(duì)B-NHL細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲轉(zhuǎn)移的影響并探討其可能的作用機(jī)制，為篩選有效的治療藥物開(kāi)辟新的途徑，為淋巴瘤合并HBV感染的治療提供更多有力的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、利用分子克隆的方法構(gòu)建H

5、Bx基因的真核載體pcDNA3.1-X。
　　2、將pcDNA3.1-X通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入B-NHL細(xì)胞SUDHL-4中，構(gòu)建整合有HBV X基因的淋巴瘤細(xì)胞株SUDHL-4-HBx，以SUDHL-4及轉(zhuǎn)染空載體的B-NHL細(xì)胞SUDHL-4-con作對(duì)照，利用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染96h內(nèi)各組細(xì)胞的增殖情況，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況。
　　3、將pcDNA3.1-X通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入SUDHL-4后，用G4

6、18篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的SUDHL-4細(xì)胞株，取對(duì)數(shù)期SUDHL-4、SUDHL-4-con和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SUDHL-4-HBx細(xì)胞，利用CCK8法檢測(cè)三種細(xì)胞96h的生長(zhǎng)情況；以SUDHL-4及轉(zhuǎn)染空載體的B-NHL細(xì)胞SUDHL-4-con作對(duì)照，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況，用改良噻唑藍(lán)法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞粘附力；用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。
　　結(jié)果：
　　1、重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果及質(zhì)粒測(cè)

7、序結(jié)果表明成功構(gòu)建pcDNA3.1-X。
　　2、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后SUDHL-4細(xì)胞有HBx mRNA的表達(dá)，與SUDHL-4組細(xì)胞及SUDHL-4-con組細(xì)胞相比，SUDHL-4-HBx細(xì)胞的增殖減緩，G0/G1期細(xì)胞比例增加、S期細(xì)胞所占比例減少，細(xì)胞凋亡率增加。
　　3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的SUDHL-4細(xì)胞有HBx mRNA及HBx蛋白的表達(dá)，與SUDHL-4和SUDHL-4-con組細(xì)胞相比，SUDHL-4-HBx細(xì)胞

8、的增殖能力、粘附力及轉(zhuǎn)移侵襲能力有不同程度增強(qiáng)；細(xì)胞周期無(wú)顯著變化，細(xì)胞凋亡率顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建整合有HBV X基因和蛋白的B-NHL細(xì)胞株SUDHL-4-HBx。
　　2、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因后，SUDHL-4-HBx細(xì)胞的增殖減緩，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，細(xì)胞凋亡率增加。
　　3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因后，SUDHL-4-HBx細(xì)胞的增殖能力及粘附力、侵襲轉(zhuǎn)移能力均顯著增強(qiáng)；細(xì)胞凋亡率顯著