人類α-突觸核蛋白核酸疫苗的構(gòu)建及其神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、研究背景： 帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見于中老年人的進(jìn)行性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。最新研究表明，在60歲以上的人口中PD的患病率約為1％，且患病危險(xiǎn)性有隨著年齡增長而增加的趨勢。目前全球有400萬PD患者，而在中國就有170萬。世界衛(wèi)生組織預(yù)測2050年全球60歲以上人口將增加三倍，據(jù)此估計(jì)到時(shí)PD患者將達(dá)1500萬以上。PD不僅影響到病人的生存質(zhì)量，而且還給家庭和社會造成了巨大的精神和經(jīng)濟(jì)

2、負(fù)擔(dān)。因此，我國近兩百萬PD病人的健康已成為不容忽視的社會公共衛(wèi)生問題。 目前PD病因未明，亦無根治辦法。PD的藥物治療還只能在多巴胺(Dopamine，DA)代謝水平上進(jìn)行對癥治療，主要藥物左旋多巴不但不能阻止疾病的進(jìn)展，還可在2-5年內(nèi)引起嚴(yán)重的運(yùn)動障礙等并發(fā)癥。因此，人們一直在努力探索新的治療方法。目前PD的治療研究包括神經(jīng)營養(yǎng)因子、基因治療、神經(jīng)干細(xì)胞移植、抗體與疫苗和中醫(yī)藥等。在疾病的各種防治手段中，免疫治療是一種方便

3、經(jīng)濟(jì)的方法。在免疫治療中，疫苗的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，不僅應(yīng)用于感染性疾病的防治，還應(yīng)用于非感染染性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病的治療。神經(jīng)變性疾病的疫苗治療已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，阿爾茨海默病(AlZheimer’sdisease，AD)的疫苗治療已有了較深入的研究。而PD的疫苗研究還處在初級階段。 Benner等首先在PD的疫苗治療方面作出了探索，用Cop-1免疫脾細(xì)胞進(jìn)行過繼性轉(zhuǎn)移，對DA能神經(jīng)元有保護(hù)作用。Masliah等用重組人類α-

4、syn蛋白接種轉(zhuǎn)基因小鼠，產(chǎn)生了特異性的神經(jīng)保護(hù)作用。免疫接種后可產(chǎn)生高親和力、高滴度的抗體，能識別人類α-syn的C末端表位；通過溶酶體途徑清除異常的α-syn蛋白，減少α-syn蛋白在DA能神經(jīng)元和突觸的聚集。 這些研究表明選擇相關(guān)抗原免疫接種或制備相關(guān)抗體可能是PD治療的突破口之一。PD的主要病理改變是黑質(zhì)致密部多DA能神經(jīng)元嚴(yán)重缺失，DA明顯減少；在殘存的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)Lewy小體。Lewy小體是PD的病理標(biāo)志物，由多種蛋

5、白異常蓄積所致，主要有α-syn、泛素、Parkin、14-3-3蛋白和synphilin-1等，其中α-syn蛋白是Lewy小體的主要構(gòu)成成分。研究發(fā)現(xiàn)這幾種蛋白和PD的發(fā)病都有關(guān)系，而α-syn蛋白的異常改變起著關(guān)鍵作用。因此，α-syn蛋白是非常有希望的治療靶點(diǎn)。 但研究發(fā)現(xiàn)主動免疫可能會激發(fā)有害的炎癥反應(yīng)。Aβ1-42免疫治療在動物模型上取得了成功，在臨床試驗(yàn)中卻意外地出現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和卒中，臨床試驗(yàn)因此被迫終

6、止。研究認(rèn)為這種炎癥反應(yīng)與細(xì)胞免疫的激活有關(guān)，重組α-syn疫苗同樣可能遇到這個(gè)問題。但免疫佐劑的發(fā)展又給疫苗研究帶來了新的希望，尤其是核酸疫苗有著豐富的免疫佐劑可供選擇。免疫佐劑能增強(qiáng)免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型。核酸疫苗的免疫佐劑包括細(xì)胞因子、非甲基化胞苷酸鳥苷、共刺激分子等核酸片段，如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、GM-CSF等。其中IL-10能使細(xì)胞免疫向體液免疫轉(zhuǎn)化，還可抑制炎癥反應(yīng)。多種神

7、經(jīng)變性疾病已開展了核酸疫苗研究，但PD至今無相關(guān)研究。構(gòu)建核酸疫苗，探索核酸疫苗對PD的免疫原性、疫苗免疫類型的調(diào)控及中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的規(guī)避，對PD與相關(guān)神經(jīng)變性疾病的預(yù)防和治療都有重要意義。故本課題采用基因工程技術(shù)融合人類α-syn基因和IL-10基因，構(gòu)建核酸疫苗，免疫PD小鼠，以期激發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用和抑制可能的炎癥反應(yīng)。 研究目的： 構(gòu)建表達(dá)人類α-syn蛋白的核酸疫苗，接種PD小鼠模型，觀察核酸疫苗的神經(jīng)

8、保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容包括：從人胚腦組織擴(kuò)增人α-syn基因，從人淋巴細(xì)胞擴(kuò)增人IL-10基因；將上述基因序列克隆到質(zhì)粒pVAX1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-haS140和pVAX1-haS140-IL-10，在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)并鑒定其生物學(xué)活性；接種正常的C57BL小鼠，觀察體液免疫的效果；大量制備核酸疫苗，接種PD小鼠模型，觀察其神經(jīng)保護(hù)作用。 方法： 1.重組質(zhì)粒pVAX1-haS140、pVAX1-haS1

9、40-IL-10的構(gòu)建和表達(dá)用RT-PCR方法從人胚腦組織擴(kuò)增人類α-syn基因，從淋巴細(xì)胞擴(kuò)增人IL-10基因。將人類α-syn基因克隆到pVAX1質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-hαS140，融合IL-10基因和α-syn基因構(gòu)建融合質(zhì)粒pVAX1-hαS140-IL-10。進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA測序鑒定。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，抽提質(zhì)粒，檢測合格后轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，用Western blot法檢測其生物學(xué)活性。

10、 2.重組質(zhì)粒對體液免疫的誘導(dǎo)分別用重組質(zhì)粒pVAX1-hαS140和pVAX1-hαS140-IL-10免疫正常的C57BL小鼠。采用肌肉注射，100μg/只/次，每三周加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次。在初免疫前和在每次免疫后二周各采血一次，分離血清用于抗體測定。用免疫后的小鼠血清和能表達(dá)α-syn的小鼠腦組織行免疫組化反應(yīng)及中和反應(yīng)，觀察免疫血清抗體的特異性。 3.核酸免疫保護(hù)作用的觀察用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-

11、四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2,3,6tetrahydropyridine,MPTP)多次注射正常的C57BL小鼠，2月后接種核酸疫苗。觀察DA能細(xì)胞的酪氨酸羥化酶和α-syn蛋白的表達(dá)水平，比較pVAX1、pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10免疫的保護(hù)效果。 結(jié)果： 1.重組質(zhì)粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10的構(gòu)建和表達(dá) 成功擴(kuò)增了

12、人類α-syn和IL-10基因，并克隆到表達(dá)載體pVAX1上，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA測序，表明重組質(zhì)粒大小、方向和序列完全正確，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10，并在哺乳動物細(xì)胞COS-7中得到有效表達(dá)，經(jīng)Western blot檢測具有較好的生物學(xué)活性。 2.重組質(zhì)粒對體液免疫的誘導(dǎo) 大量制備pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10兩種重組質(zhì)

13、粒和空質(zhì)粒pVAX1。重組質(zhì)粒免疫動物后產(chǎn)生了較高的抗體滴度，pVAX1-hαS140-IL-10組(3.591±0.54)×10 3，pVAX1-hαS140組(1.29±0.65)×103(p＜0.01)。重組質(zhì)粒免疫的小鼠血清和能和α-syn過表達(dá)的小鼠腦組織發(fā)生特異性的免疫組化反應(yīng)，被α-syn蛋白中和的血清則不發(fā)生反應(yīng)。 3.核酸疫苗的免疫保護(hù)作用觀察 核酸疫苗pVAX1-hαS140組、pVAX1-hαS14

14、0-IL-10組與空質(zhì)粒pVAX1組比較，p＜0.01，有差異顯著性，都有較好的免疫效果。pVAX1-hαS140組與pVAX1-hαS140-IL-10組比較，0.01＜p＜0.05，差異顯著性，pVAX1-hαS140-IL-10優(yōu)于pVAX1-hαS140。 結(jié)論： 1.本研究成功構(gòu)建了pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10兩種真核表達(dá)質(zhì)粒，具有較好的生物學(xué)活性。 2.重組質(zhì)粒免疫后