魚藤酮誘導(dǎo)α-突觸核蛋白聚集及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分: 目的：探討魚藤酮對(duì)多巴胺能細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制。 方法：采用不同濃度魚藤酮處理PC12細(xì)胞24小時(shí)，用噻唑藍(lán)比色法檢測細(xì)胞活性，Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和線粒體膜電位，比色法檢測細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，熒光底物酶活性法檢測caspase 3活性；此外，采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理30分鐘，檢測上述指標(biāo)。 結(jié)果：與正常組相比，10nmo

2、l/L、100nmol/L、1μmol/L和10μmol/L魚藤酮處理PC12細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性下降(P<0.05),其中1μmol/L組MTT吸光度為正常組的42.1％，凋亡率為41.9％。Hoechst 33258染色可見魚藤酮組具有不同時(shí)期凋亡核特征的細(xì)胞。魚藤酮處理后，除10nmol/L組細(xì)胞內(nèi)DHE熒光強(qiáng)度與正常組無顯著差異外（P>0.05），余各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平均增高，線粒體膜電位下降及cas

3、pase 3活性增高（P<0.05），其變化程度亦呈藥物劑量依賴性。谷胱甘肽水平在10nmol/L、100nmol/L魚藤酮組分別為正常的144％和117％（P<0.05），1μmol/L和10μmol/L組分別下降15％和42％（P<0.05）。N-乙酰半胱氨酸（500μmol/L和2.5mmol/L）預(yù)處理30分鐘，可部分抑制1μmol/L魚藤酮所致的上述效應(yīng)（P<0.05）。 結(jié)論：魚藤酮處理可誘導(dǎo)多巴胺能細(xì)胞凋亡，其機(jī)制

4、與氧化應(yīng)激和線粒體膜電位下降有關(guān)；而且PC12細(xì)胞凋亡率具有魚藤酮?jiǎng)┝恳蕾囆?；采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理，可通過抗氧化應(yīng)激抑制魚藤酮的毒性效應(yīng)，該藥物對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。 第二部分: 目的：探討魚藤酮對(duì)多巴胺能細(xì)胞α-突觸核蛋白表達(dá)和聚集的影響。 方法：采用不同濃度魚藤酮（10nmol/L、100nmol/L和1μmol/L）處理PC12細(xì)胞24小時(shí)，Western 印跡法檢測α-突觸核蛋白表達(dá)水平；免疫

5、熒光共聚焦法觀察胞漿內(nèi)α-突觸核蛋白聚集物的形成，及硫磺素S染料染色初步了解聚集物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。此外，采用N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理（在魚藤酮作用前30分鐘開始預(yù)處理），與1μmol/L魚藤酮組比較α-突觸核蛋白表達(dá)水平有無變化，以及該抗氧化劑對(duì)α-突觸核蛋白聚集物形成的影響。 結(jié)果：Western印跡法顯示，魚藤酮組胞漿內(nèi)α-突觸核蛋白表達(dá)水平較正常組顯著升高（P<0.05），而且升高的程度呈劑量依賴性；其中，1μmol/L組采用N

6、-乙酰半胱氨酸（500μmol/L）預(yù)處理后，α-突觸核蛋白表達(dá)水平明顯下降（P<0.05），但仍高于正常組（P<0.05）。免疫熒光共聚焦結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞胞漿內(nèi)α-突觸核蛋白散在分布，1μmol/L魚藤酮組可見α-突觸核蛋白免疫陽性的聚集物形成，呈硫磺素S染色陰性；采用N-乙酰半胱氨酸（500μmol/L）預(yù)處理后，聚集物數(shù)量減少，體積縮小。 結(jié)論：魚藤酮處理可誘導(dǎo)多巴胺能細(xì)胞α-突觸核蛋白的表達(dá)，促進(jìn)α-突觸核蛋白聚集物

7、的形成；而且上述過程均與氧化應(yīng)激有關(guān)。 第三部分: 目的：探討魚藤酮誘導(dǎo)多巴胺能細(xì)胞α-突觸核蛋白表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。 方法：采用不同濃度魚藤酮（10nmol/L、100nmol/L和1μmol/L）處理PC12細(xì)胞24小時(shí)及N-乙酰半胱氨酸（500μmol/L）預(yù)處理30分鐘，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白mRNA水平。于1μmol/L魚藤酮處理的不同時(shí)間點(diǎn)（2、6、12、18、24小時(shí)），收集細(xì)胞，

8、采用熒光底物酶活性法檢測20S三種酶水解活性（胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽基谷氨?；饷福?；同時(shí)Western印跡法觀察α-突觸核蛋白表達(dá)與時(shí)間的相關(guān)性。 結(jié)果：采用魚藤酮處理PC12細(xì)胞24小時(shí)后，α-突觸核蛋白mRNA水平較正常組顯著升高（P<0.05），升高的程度呈劑量依賴性；1μmol/L魚藤酮組采用N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理30分鐘，該指標(biāo)較魚藤酮組顯著下降（P<0.05）。1μmol/L魚藤酮處理PC12細(xì)胞，于2小時(shí)20S

9、蛋白酶體酶水解活性開始顯著下降（P<0.05），下降的程度具有時(shí)間依賴性；而α-突觸核蛋白表達(dá)水平于6小時(shí)開始升高（P<0.05）。N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理可部分抑制1μmol/L魚藤酮誘導(dǎo)的蛋白酶體酶活性損傷（P<0.05）。 結(jié)論：魚藤酮可誘導(dǎo)α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)錄水平升高及20S蛋白酶體酶水解活性下降，從而促進(jìn)α-突觸核蛋白表達(dá)水平的提高；其機(jī)制均與氧化應(yīng)激有關(guān)。 第四部分: 目的：探討多巴胺能細(xì)胞內(nèi)多巴胺在魚藤

10、酮的細(xì)胞毒性和α-突觸核蛋白聚集過程中的作用。 方法：采用魚藤酮（1μmol/L）處理PC12細(xì)胞，噻唑藍(lán)比色法檢測細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測DHR123熒光強(qiáng)度（即細(xì)胞內(nèi)活性氧水平）；Western印跡法檢測胞漿內(nèi)α-突觸核蛋白表達(dá)；免疫熒光法觀察α-突觸核蛋白聚集物。并采用多巴胺耗竭劑—利血平預(yù)處理3小時(shí)，觀察上述指標(biāo)。 結(jié)果：1μmol/L魚藤酮處理PC12細(xì)胞24小時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞活力較正常組顯著下降（P<0.05），

11、吸光度為0.730±0.01（正常組為1.112±0.025）；利血平（1μmol/L和5μmol/L）預(yù)處理后再給予魚藤酮，孵育24小時(shí)后，吸光度分別為0.945±0.02和1.06±0.03，細(xì)胞活力較魚藤酮組顯著升高（P<0.05）。魚藤酮處理24小時(shí)，過氧化物水平升高至正常組的281％，而利血平（1μmol/L和5μmol/L）預(yù)處理后，分別降至正常組的248％和232％，與魚藤酮組比較有顯著差異（P<0.05）。魚藤酮處理后，