鐵誘導(dǎo)alpha-突觸核蛋白聚集的機(jī)制研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以肌強(qiáng)直、肢體震顫和運動減少等癥狀為主要臨床表現(xiàn)。其主要病理特征為黑質(zhì)(substantia nigra，SN)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的缺失和細(xì)胞內(nèi)路易小體(Lewy bodies，LBs)的形成。我國65歲以上的人群PD的患病率為1.7％，隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和老齡化社會的加劇，PD的發(fā)病率勢必進(jìn)一步攀升。但是由于該病的確切

2、病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，使之無法從根本上預(yù)防和治療PD并延緩其進(jìn)展，因此，深入探討PD的發(fā)病機(jī)制無疑對推動PD的防治具有重要的科學(xué)意義。
　　 鐵在PD的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵的作用，過量的游離鐵，特別是Fe2+可以通過Fenton反應(yīng)形成羥自由基(hydroxyl radical，OH.)，而Fe3+則可以通過Haber-Weiss循環(huán)還原成Fe2+進(jìn)而生成OH·。OH·通過損傷蛋白質(zhì)、核酸、和含有大量未飽和脂肪酸的細(xì)胞膜，最終導(dǎo)

3、致細(xì)胞死亡。目前已有大量證據(jù)表明alpha-突觸核蛋白在PD的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。Alpha-突觸核蛋白的過量表達(dá)可以導(dǎo)致其聚集體的形成并對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。神經(jīng)病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)以alpha-突觸核蛋白異常聚集為主要病理變化的多種突觸蛋白病往往伴有鐵的堆積，說明鐵與alpha-突觸核蛋白聚集之間存在一定聯(lián)系。另有實驗證實Fe2+和Fe3+可在體外及細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)alpha-突觸核蛋白的聚集。最近，人們在alpha-突觸核蛋白的5’端未翻譯區(qū)

4、(untranslated region，UTR)發(fā)現(xiàn)了類鐵反應(yīng)元件(iron responsive element，IRE)，這一發(fā)現(xiàn)為鐵可能通過增加alpha-突觸核蛋白的表達(dá)導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的死亡提供了依據(jù)。為了探討鐵誘導(dǎo)alpha-突觸核蛋白聚集的機(jī)制，本實驗應(yīng)用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法，流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM），硫磺素S和熒光雙標(biāo)記，逆轉(zhuǎn)錄多

5、聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)及免疫印跡等多種實驗方法，在SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中觀察抗氧化劑維生素E(vitamin E，VE)對鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和alpha-突觸核蛋白聚集情況的變化，探討鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與alpha-突觸核蛋白聚集之間的關(guān)系:構(gòu)建含有alpha-突觸核蛋白mRNA5’-UTR類IRE的質(zhì)粒alpha-synuclei

6、n-IRE-Luc，應(yīng)用雙熒光素酶檢測(dual luciferase reporter assay)的方法在HEK293細(xì)胞中探討其是否是功能性的鐵反應(yīng)元件，并在SK-N-SH細(xì)胞中證實鐵可以通過鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory proteins，IRPs)-IRE系統(tǒng)調(diào)節(jié)alpha-突觸核蛋白的表達(dá)。結(jié)果如下：
　　 1、1 mmol/L Fe2+和Fe3+處理SK-N-SH細(xì)胞24h，細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞內(nèi)活性氧

7、物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）生成增加，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞內(nèi)alpha-突觸核蛋白的聚集較對照組明顯增多；
　　 2、5 umol/L VE與1 mmol/L Fe2+或1 mmol/L Fe3+共孵育SK-N-SH細(xì)胞24h可以完全抑制鐵誘導(dǎo)的ROS生成和細(xì)胞存活率的下降；5 umol/L VE能部分但不能完全阻斷細(xì)胞內(nèi)alpha-突觸核蛋白聚集，提示氧化應(yīng)激部分

8、參與了鐵誘導(dǎo)的alpha-突觸核蛋白聚集；
　　 3、成功構(gòu)建了攜帶alpha-突觸核蛋白mRNA5’-UTR類IRE的alpha-synuclein-IRE-Luc熒光素酶報告載體，應(yīng)用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)在HEK293細(xì)胞中檢測插入的類IRE在轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)節(jié)：同時構(gòu)建了攜帶Ferroportinl mRNA5'-UTR IRE的Ferroportinl-IRE-Luc熒光素酶報告載體作為陽性對照；
　　 4、1 m

9、mol/LFe3+孵育HEK293細(xì)胞可使alpha-synuclein-IRE-Luc轉(zhuǎn)染組熒光素酶的表達(dá)上調(diào)，與陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);100 umol/L去鐵胺(deferoxamine mesylate，DFO)孵育HEK293細(xì)胞則alpha-synuclein-IRE-Luc轉(zhuǎn)染組熒光素酶的表達(dá)下調(diào)，與陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，提示此類IRE具有鐵反應(yīng)性；
　　 5、IR

10、P1的干涉載體pSilencerl.0-U6-IRP1與熒光素酶報告載體pRL-TK，alpha-synuclein-IRE-Luc共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)IRP1表達(dá)水平后alpha-synuclein-IRE-Luc轉(zhuǎn)染組熒光素酶的表達(dá)上調(diào)，與陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而IRP1的高表達(dá)載體pCMV6-AC-ACO1與pRL-TK，alpha-synuclein-IRE-Luc共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞增

11、加細(xì)胞內(nèi)IRP1表達(dá)后則可下調(diào)熒光素酶的表達(dá)，與陰性對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示插入的類IRE受細(xì)胞內(nèi)IRP表達(dá)水平的調(diào)節(jié)；
　　 6、pSilencerl.0-U6－IRP1轉(zhuǎn)染SK-N-SH細(xì)胞后可使細(xì)胞內(nèi)alpha-突觸核蛋白mRNA和蛋白水平均增加，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），同時轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)alpha-突觸核蛋白的聚集較對照組明顯增多。
　　 上述實驗結(jié)果表明：細(xì)胞內(nèi)鐵水平

12、可以通過氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)alpha-突觸核蛋白聚集體的形成，VE完全阻斷氧化應(yīng)激后并未完全緩解alpha-突觸核蛋白的聚集，提示氧化應(yīng)激僅部分參與了鐵誘導(dǎo)alpha-突觸核蛋白聚集；構(gòu)建的alpha-synuclein-IRE-Luc熒光素酶報告載體的轉(zhuǎn)錄受細(xì)胞內(nèi)鐵水平和IRP1表達(dá)水平的調(diào)控，提示alpha-突觸核蛋白5’-UTR區(qū)的類IRE是一個功能性元件；細(xì)胞內(nèi)的鐵可以通過IRE/IRP系統(tǒng)調(diào)控alpha-突觸