GLP-1受體激動(dòng)劑Exendin-4改善老齡大鼠骨質(zhì)疏松作用機(jī)理的研究.pdf

1、目的:
　　骨質(zhì)疏松是老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病,全球50歲以上的人群中,1/3的女性和1/5的男性患有骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的并發(fā)癥是各種類(lèi)型的骨折,美國(guó)每年因骨質(zhì)疏松發(fā)生骨折的人數(shù)超過(guò)心肌梗死和腦卒中的總和,其中髖部骨折的死亡率為24％,危害性不容忽視。隨著人口老齡化形勢(shì)日趨嚴(yán)峻,骨質(zhì)疏松已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。骨質(zhì)疏松的基本病理機(jī)制是骨重建過(guò)程中成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收的穩(wěn)態(tài)失衡,骨吸收量大于

2、骨形成量,進(jìn)而引起骨量減少,骨脆性增加,易發(fā)生骨折。目前臨床治療骨質(zhì)疏松的藥物絕大多數(shù)是作用于破骨細(xì)胞,這類(lèi)藥物通過(guò)抑制破骨細(xì)胞骨吸收作用延緩骨量丟失,對(duì)于已經(jīng)丟失的骨組織無(wú)作用,既不能恢復(fù)骨量和骨質(zhì)結(jié)構(gòu),也不能促進(jìn)新骨形成。因此,探索和研制促進(jìn)骨形成的新藥物,是當(dāng)前防治骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)
　　胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一種重要的腸道內(nèi)分泌激素。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)

3、現(xiàn),應(yīng)用 GLP-1受體激動(dòng)劑 Exendin-4后,能夠顯著改善去卵巢(OVX)所致大鼠骨質(zhì)疏松。但是,在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上均未發(fā)現(xiàn) GLP-1受體,提示 GLP-1可能通過(guò)間接機(jī)制發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。鑒于成骨細(xì)胞由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化而來(lái),BMSCs上有 GLP-1受體,據(jù)此我們提出假說(shuō): GLP-1可能通過(guò)與 BMSCs表面的GLP-1受體結(jié)合,促進(jìn) BMSCs向成骨細(xì)胞分化,繼而促進(jìn)骨形成,改善骨質(zhì)疏松。為證實(shí)此

4、假說(shuō),本課題擬在離體和整體水平展開(kāi) GLP-1受體調(diào)控 BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用、分子調(diào)控機(jī)制和應(yīng)用 GLP-1受體激動(dòng)劑改善老齡大鼠骨質(zhì)疏松療效的研究。
　　方法:
　　1.大鼠骨生物力學(xué)和形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的檢測(cè):選取4月齡、12月齡、20月齡自然增齡的SD雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)腹腔注射GLP-1受體激動(dòng)劑Exendin-4(5μg/kg/d)進(jìn)行治療,給藥12周后,取左側(cè)股骨采用Micro-CT進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量

5、學(xué)分析,觀察骨密度(BMD)和骨小梁微結(jié)構(gòu)的變化;取右側(cè)股骨采用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)進(jìn)行骨生物力學(xué)測(cè)試;取雙側(cè)脛骨分別進(jìn)行硬組織切片及脫鈣處理后切片,硬組織切片通過(guò)鈣黃綠素和四環(huán)素雙熒光標(biāo)記分析新骨形成速度,脫鈣后的骨組織切片進(jìn)行HE染色和甲苯胺藍(lán)染色分析骨髓成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞數(shù)量。
　　2.大鼠骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè):大鼠處死前置于代謝籠中,禁食但自由飲水,收集24 h尿液,離心后取上清;收集尿液后處死動(dòng)物,通過(guò)腹主動(dòng)脈采血5 ml,

6、離心后取血清。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清Ca、P及尿液Ca、P的水平;ELISA試劑盒檢測(cè)血清中骨特異性堿性磷酸酶(BAP)和骨鈣素(OCN)的含量。
　　3.BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定:選取3周齡的SD大鼠,脫頸處死后取雙側(cè)股骨及脛骨,剪去兩端骨骺,用α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔,制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液離心后棄上清,加入含10%FBS和雙抗的α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)吹打,直至成為均勻的細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶中;每3d換液一次;傳代培

7、養(yǎng)至第三代細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原 CD29、CD45;分別進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng),觀察BMSCs向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化的能力。
　　4.GLP-1受體表達(dá)分析:分離培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)鑒定后,采用GLP-1受體抗體和Hoechst抗體進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)分析,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察 GLP-1受體在BMSCs的表達(dá)情況;再通過(guò)RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)BMSCs上GLP-1受體的基因和蛋白表達(dá)水平。

8、
　　5.Exendin-4對(duì)BMSCs增殖及分化的影響:向BMSCs培養(yǎng)板中分別加入10-9、10-8、10-7 M濃度的Exendin-4,48 h后,采用MTT進(jìn)行細(xì)胞增殖分析;采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%FBS、10mMβ-甘油磷酸鈉、10nM地塞米松,50μg/L維生素C的α-MEM)誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs,培養(yǎng)21 d后對(duì)鈣化結(jié)節(jié)進(jìn)行茜素紅染色,采用RT-PCR方法檢測(cè)成骨相關(guān)基因Runx-2和Oc的表達(dá),觀察Exendi

9、n-4對(duì)BMSCs成骨分化的影響;采用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%FBS、5μg/ml胰島素、1μM地塞米松、0.5mM IBMX、100μM吲哚美辛的α-MEM)誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs,培養(yǎng)17 d后,對(duì)細(xì)胞內(nèi)形成的脂滴進(jìn)行油紅O染色,采用RT-PCR方法檢測(cè)成脂相關(guān)基因Pparγ和C/ebpα的表達(dá),觀察Exendin-4對(duì)BMSCs成脂分化的影響。
　　6.BMSCs分化相關(guān)信號(hào)分子的檢測(cè):向BMSCs培養(yǎng)板中加入濃度為10-8 M

10、的Exendin-4處理,采用Western blot方法檢測(cè)處理0 h、1h、2h、4h、8h、24h后不同時(shí)間點(diǎn)的胞漿及胞核中β-catenin的表達(dá);構(gòu)建GLP-1R-shRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSCs,沉默GLP-1受體基因的表達(dá),然后用Exendin-4處理細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PKA、胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá),同時(shí)應(yīng)用腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin、PKA抑制劑H-89、GLP-1R拮抗劑Ex(9-39)對(duì)GLP-

11、1受體激動(dòng)劑成骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中的BMSCs給予干預(yù)后,分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PKA和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.Exendin-4能夠改善老齡大鼠骨質(zhì)疏松:Micro-CT分析結(jié)果顯示,老齡組大鼠(20月齡)與青年組大鼠(4月齡)相比,骨密度顯著降低,骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,應(yīng)用 GLP-1受體激動(dòng)劑 Exendin-4可以顯著增強(qiáng)骨密度,改善骨小梁微結(jié)構(gòu)的破壞;三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果顯示,Exendin-4

12、能夠顯著改善老齡組大鼠股骨的生物力學(xué)特性,增強(qiáng)股骨的機(jī)械強(qiáng)度;生化分析結(jié)果表明,Exendin-4可以顯著減少老齡組大鼠尿液中鈣磷流失,升高血清中BAP和OCN水平,提示Exendin-4抑制破骨細(xì)胞活動(dòng)的同時(shí)可能促進(jìn)了成骨細(xì)胞活性;骨組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果表明,Exendin-4可以提高老齡組大鼠 BFR和MAR,能夠增加骨髓中成骨細(xì)胞數(shù)量,減少骨髓中脂肪細(xì)胞數(shù)量,具有促進(jìn)骨形成的作用。
　　2.Exendin-4促進(jìn) BMSCs增

13、殖以及向成骨細(xì)胞分化,抑制向脂肪細(xì)胞分化:RT-PCR、Western Blot和免疫熒光的檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)BMSCs上確實(shí)有GLP-1R表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GLP-1和Exendin-4可以濃度依賴(lài)性促進(jìn)BMSCs增殖。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,Exendin-4可以促進(jìn)成骨分化標(biāo)志基因Runx-2和Bglap的表達(dá),使成骨過(guò)程中的礦化結(jié)節(jié)增多,骨形成功能增強(qiáng)。在成脂誘導(dǎo)條件下,Exendin-4可以抑制成脂分化標(biāo)志基因Pparγ和C

14、/ebpα的表達(dá),使成脂過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)脂滴生成減少,抑制脂肪細(xì)胞形成。
　　3.Exendin-4調(diào)控BMSCs分化的作用及分子機(jī)制:隨著給予Exendin-4處理時(shí)間的延長(zhǎng),胞漿中β-catenin的表達(dá)逐漸減少,胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá)逐漸增加,表明Exendin-4可以促進(jìn)β-catenin轉(zhuǎn)位入核。給予腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin后,細(xì)胞內(nèi)PKA和胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平升高;給予PKA抑制劑H-89

15、或GLP-1R拮抗劑Ex(9-39)后,細(xì)胞內(nèi)PKA和胞核β-catenin的表達(dá)水平降低;沉默GLP-1受體基因的表達(dá)可明顯降低細(xì)胞內(nèi)PKA和胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平。上述結(jié)果表明,GLP-1受體激動(dòng)劑Exendin-4可能通過(guò)活化PKA激活BMSCs上的Wnt信號(hào)通路,進(jìn)而引起β-catenin轉(zhuǎn)位入核,激活成骨分化相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn) BMSCs向成骨細(xì)胞分化。
　　結(jié)論:
　　1.GLP-1受體激動(dòng)劑Exe