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文檔簡介
1、硒是人和動物所必需的微量元素之一。日糧硒缺乏能夠引起一系列缺硒性疾病的發(fā)生。心肌損傷是雞缺硒性疾病中的典型病理變化。因此對缺硒引起心肌損傷的發(fā)生發(fā)展機制及生物學指標的研究具有重要的意義。近些年來microRNAs一直是科學家們的研究熱點,1993年科學家第一次在線蟲體內發(fā)現(xiàn)microRNA(lin-4),2001年Science報道了在人、線蟲、果蠅體內也發(fā)現(xiàn)了類似lin-4的小分子RNA,由此命名為microRNA。MicroRNA是
2、大約19~25nt長的非編碼RNA,廣泛存在于真核生物中,根據(jù)目前的研究報道,我們發(fā)現(xiàn)microRNA能夠調控基因的翻譯。同時越來越多的證據(jù)表明microRNA與多種生物學過程、疾病發(fā)生相關。研究表明microRNAs在心肌疾病的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)mir-30b與心臟疾病之間有很大的關聯(lián),且與硒元素有關。為探討mir-30b的靶基因及其在缺硒性心肌凋亡中的作用,本研究通過復制缺硒雞模型,應用超微結構觀察、實時熒光定
3、量PCR技術、熒光素酶雙報告基因、TUNEL等技術等,檢測了缺硒心肌中凋亡及其相關基因(Bcl-2、Bax、Caspase3)和Oxr1 mRNA以及mir-30b的表達,氧化應激(GPx、SOD、CAT、GSH、H2O2、·OH、iNOS、NO、MDA)指標。在建立體外mir-30b過表達和敲低的原代心肌細胞模型基礎上,預測并驗證了mir-30b的靶基因是Oxr1,應用H2O2和NAC處理mir-30b敲低和過表達體外培養(yǎng)心肌細胞模型
4、,檢測心肌細胞ROS的含量、細胞凋亡及其相關基因的表達。試驗結果表明:
1.在建立雞原代體外培養(yǎng)心肌細胞模型的基礎上,成功構建了mir-30b過表達和敲低模型,過表達效率為67倍,敲低效率是0.43倍。利用生物信息學預測軟件TargetScan和MiRDB預測了miR-30b靶基因,通過構建了熒光素酶雙報告基因和RT-PCR的方法驗證了Oxr1是miR-30b的靶基因。
2.低硒飼料能夠引起雞心肌組織中mir-30b
5、表達上調和Oxr1表達下調,mir-30b上調9.74倍,Oxr1表達下調99倍,與對照組差異顯著(P<0.05);促凋亡基因Caspase3和Bax表達上調,與對照組相比差異顯著(P<0.05),抑凋亡基因Bcl-2顯著低于正常組,同時超微組織觀察的結果發(fā)現(xiàn)心肌凋亡顯著增多。心肌組織發(fā)生氧化應激,GPx、SOD、CAT、GSH活性下降,H2O2、·OH增多,iNOS活性、NO和MDA含量增加。上述結果表明,mir-30b和其靶基因Ox
6、r1與低硒引起氧化應激誘導的心肌細胞凋亡相關。
3.在建立雞原代體外培養(yǎng)心肌細胞mir-30b過表達和敲除模型的基礎上,用H2O2和NAC處理細胞,結果表明心肌細胞敲低mir-30b后,細胞中ROS的水平和心肌細胞凋亡率下降,Caspase-3和Bax表達下調, Bcl-2表達上調,與正常組差異顯著(P<0.05),心肌細胞過表達mir-30b則表現(xiàn)出相反的結果,上述結果表明mir-30b能夠通過抑制Oxr1表達引起發(fā)生氧化應
7、激誘導心肌細胞凋亡。
綜上所述,低硒日糧能夠引起mir-30b、Caspase-3和Bax表達升高、Oxr1和Bcl-2表達下降,心肌組織發(fā)生氧化應激和細胞凋亡,體外試驗證實,Oxr1為mir-30b的靶基因,mir-30b能夠抑制Oxr1表達,mir-30b過表達引起心肌細胞ROS含量和細胞凋亡增加,Caspase-3和Bax表達升高、Oxr1和Bcl-2表達下降,上述結果表明,雞低硒日糧能夠引起心肌組織mir-30b表達上
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