Mir-30b抑制Oxr1在雞缺硒性心肌細(xì)胞凋亡中作用機(jī)制的研究.pdf

1、硒是人和動(dòng)物所必需的微量元素之一。日糧硒缺乏能夠引起一系列缺硒性疾病的發(fā)生。心肌損傷是雞缺硒性疾病中的典型病理變化。因此對(duì)缺硒引起心肌損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及生物學(xué)指標(biāo)的研究具有重要的意義。近些年來(lái)microRNAs一直是科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)，1993年科學(xué)家第一次在線蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)microRNA(lin-4)，2001年Science報(bào)道了在人、線蟲(chóng)、果蠅體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似lin-4的小分子RNA，由此命名為microRNA。MicroRNA是

2、大約19～25nt長(zhǎng)的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，根據(jù)目前的研究報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)microRNA能夠調(diào)控基因的翻譯。同時(shí)越來(lái)越多的證據(jù)表明microRNA與多種生物學(xué)過(guò)程、疾病發(fā)生相關(guān)。研究表明microRNAs在心肌疾病的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)mir-30b與心臟疾病之間有很大的關(guān)聯(lián)，且與硒元素有關(guān)。為探討mir-30b的靶基因及其在缺硒性心肌凋亡中的作用，本研究通過(guò)復(fù)制缺硒雞模型，應(yīng)用超微結(jié)構(gòu)觀察、實(shí)時(shí)熒光定

3、量PCR技術(shù)、熒光素酶雙報(bào)告基因、TUNEL等技術(shù)等，檢測(cè)了缺硒心肌中凋亡及其相關(guān)基因(Bcl-2、Bax、Caspase3)和Oxr1 mRNA以及mir-30b的表達(dá)，氧化應(yīng)激(GPx、SOD、CAT、GSH、H2O2、·OH、iNOS、NO、MDA)指標(biāo)。在建立體外mir-30b過(guò)表達(dá)和敲低的原代心肌細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了mir-30b的靶基因是Oxr1，應(yīng)用H2O2和NAC處理mir-30b敲低和過(guò)表達(dá)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞模型

4、，檢測(cè)心肌細(xì)胞ROS的含量、細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因的表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明:
　　1.在建立雞原代體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了mir-30b過(guò)表達(dá)和敲低模型，過(guò)表達(dá)效率為67倍，敲低效率是0.43倍。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件TargetScan和MiRDB預(yù)測(cè)了miR-30b靶基因，通過(guò)構(gòu)建了熒光素酶雙報(bào)告基因和RT-PCR的方法驗(yàn)證了Oxr1是miR-30b的靶基因。
　　2.低硒飼料能夠引起雞心肌組織中mir-30b

5、表達(dá)上調(diào)和Oxr1表達(dá)下調(diào)，mir-30b上調(diào)9.74倍，Oxr1表達(dá)下調(diào)99倍，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05);促凋亡基因Caspase3和Bax表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，抑凋亡基因Bcl-2顯著低于正常組，同時(shí)超微組織觀察的結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌凋亡顯著增多。心肌組織發(fā)生氧化應(yīng)激，GPx、SOD、CAT、GSH活性下降，H2O2、·OH增多，iNOS活性、NO和MDA含量增加。上述結(jié)果表明，mir-30b和其靶基因Ox

6、r1與低硒引起氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。
　　3.在建立雞原代體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞mir-30b過(guò)表達(dá)和敲除模型的基礎(chǔ)上，用H2O2和NAC處理細(xì)胞，結(jié)果表明心肌細(xì)胞敲低mir-30b后，細(xì)胞中ROS的水平和心肌細(xì)胞凋亡率下降，Caspase-3和Bax表達(dá)下調(diào)， Bcl-2表達(dá)上調(diào)，與正常組差異顯著(P＜0.05)，心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)mir-30b則表現(xiàn)出相反的結(jié)果，上述結(jié)果表明mir-30b能夠通過(guò)抑制Oxr1表達(dá)引起發(fā)生氧化應(yīng)

7、激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。
　　綜上所述，低硒日糧能夠引起mir-30b、Caspase-3和Bax表達(dá)升高、Oxr1和Bcl-2表達(dá)下降，心肌組織發(fā)生氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，體外試驗(yàn)證實(shí)，Oxr1為mir-30b的靶基因，mir-30b能夠抑制Oxr1表達(dá)，mir-30b過(guò)表達(dá)引起心肌細(xì)胞ROS含量和細(xì)胞凋亡增加，Caspase-3和Bax表達(dá)升高、Oxr1和Bcl-2表達(dá)下降，上述結(jié)果表明，雞低硒日糧能夠引起心肌組織mir-30b表達(dá)上