膽堿能抗炎通路參與遠隔缺血后處理減輕心肺復蘇后腦損傷的研究.pdf

1、心臟驟停發(fā)生后，腦組織缺血缺氧損傷以及心肺復蘇后的再灌注損傷，都將造成造成神經(jīng)元廣泛凋亡、壞死，引起相應的神經(jīng)功能缺損。研究數(shù)據(jù)表明心肺復蘇后存活患者中只有不到5％達到滿意的神經(jīng)功能恢復。有效減輕復蘇后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，是一個亟待解決的醫(yī)學難題，也是長期以來人們探索的重點和熱點之一。
　　遠隔缺血后處理（Remote ischemic postconditioning，RIPost）是一種新的器官保護策略，既往研究發(fā)現(xiàn) RIPost

2、能夠明顯減輕心、腦等器官的缺血再灌注損傷，我們課題組前期研究證明遠隔缺血后處理可減輕心肺復蘇后腦損傷。然而，RIPost的器官保護機制未完全明確。炎癥反應作為心肺復蘇后腦損傷的重要發(fā)病機制之一，貫穿了整個病理過程的始終，亦是導致神經(jīng)元損傷的主要原因之一， RIPost對靶器官炎癥反應的抑制作用得到了一些實驗研究的證實。膽堿能抗炎通路（ Cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）以迷走神經(jīng)、乙酰膽

3、堿及特異的乙酰膽堿受體為基礎，激活后可以有效減少多種促炎因子的釋放。在有關遠隔缺血處理的研究中，發(fā)現(xiàn)給予神經(jīng)節(jié)阻斷劑或者迷走神經(jīng)切斷會消除缺血處理的腦保護作用，這提示CAP與RIPost很有可能具有一定聯(lián)系。我們在前期預實驗中觀察到RIPost不僅能夠降低大鼠心肺復蘇后海馬部位和血液中IL-1β、IL-6以及TNF-α等炎性因子的水平，還能夠提高腦乙酰膽堿（Acetylcholine，Ach）的水平，頸迷走神經(jīng)切斷后，RIPost腦保護

4、作用明顯減弱。
　　因此，本課題研究膽堿能抗炎通路是否參與了RIPost減輕心肺復蘇腦損傷，不僅為心肺復蘇后腦損傷探索新的、具有臨床意義的治療思路，而且為 RIPost的腦保護作用提供新的理論依據(jù)，更為研發(fā)調控神經(jīng)炎癥發(fā)揮腦保護作用的藥物提供新的靶點。
　　實驗一遠隔缺血后處理對心肺復蘇后腦損傷炎癥反應的影響
　　目的：探討RIPost對大鼠心肺復蘇后腦損傷炎癥反應的影響。
　　方法：雄性SD大鼠69只，隨機分為

5、5組：假手術組（sham組，n=9）、對照組（control組，n=15）、遠隔缺血后處理A組（RIPost_A組，n=15）、遠隔缺血后處理B組（RIPost_B組，n=15）、遠隔缺血后處理C組（RIPost_C組，n=15）。sham組大鼠僅行氣管插管及動靜脈穿刺，control組大鼠窒息8 min后復蘇，RIPost_A組大鼠在自主循環(huán)恢復（ROSC）后即刻用止血帶對右下肢行3個循環(huán)的后處理，每個循環(huán)結扎與開放均持續(xù)15 min

6、，RIPost_B組大鼠在ROSC后即刻及3h對右下肢各行3個循環(huán)結扎與開放，RIPost_C組在ROSC后即刻、3h及6h對右下肢各行3個循環(huán)結扎與開放。觀察復蘇成功率；采用ELISA法檢測ROSC后1h（T1）、8h（T2）及24h（T3）血漿IL-1β、TNF-α及HMGB-1水平，ROSC后24h大鼠皮層及海馬組織IL-1β、TNF-α及HMGB-1含量，ROSC后48h血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）濃度；ROSC后1d、3

7、d、5d及7d行神經(jīng)元缺損評分（NDS）；ROSC后4d行Morris水迷宮實驗；采用Nissl染色法計算ROSC后8d大鼠海馬CA1存活神經(jīng)元數(shù)目。
　　結果：與sham組相比，control組及RIPost_A-C組各時間點NDS評分及降低；血漿、皮層及海馬IL-1β、TNF-α、HMGB-1及NSE濃度升高；海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少，結構不清；逃避潛伏期延長，靶象限停留時間及穿越平臺次數(shù)降低（P＜0.05）。與contro

8、l組相比，RIPost_A-C組各時間點NDS評分升高；血漿、皮層及海馬IL-1β、TNF-α、HMGB-1及NSE濃度降低；海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目增加，損傷程度減輕；逃避潛伏期縮短，靶象限停留時間及穿越平臺次數(shù)升高（P＜0.05）。與RIPost_A組相比，RIPost_B-C組1d NDS評分升高；血漿T2，T3時間點IL-1β、TNF-α、HMGB-1及NSE濃度降低；海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目增加，損傷程度減輕（P＜0.05）；其余

9、指標無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；RIPost_B與RIPost_C組各檢測指標無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　結論：遠隔缺血后處理降低炎癥反應，減輕大鼠心肺復蘇后腦損傷；復蘇后6h遠隔缺血后處理抗炎作用減弱，不能增強其對大鼠心肺復蘇后腦損傷的保護作用。
　　實驗二遠隔缺血后處理對心肺復蘇后Ach及α7nAChR的影響
　　目的：觀察遠隔缺血后處理對心肺復蘇后Ach和α7nAChR表達的影響，探索其腦保護作用與膽堿

10、能抗炎通路的聯(lián)系。
　　方法：雄性SD大鼠26只，隨機分3組：假手術組（sham組，n=6）、模型組（CA組，n=10）、遠隔缺血后處理組（RIPost組，n=10）。sham組氣管插管及動靜脈置管， CA組窒息8min后復蘇，RIPost組在ROSC后即刻及3h以止血帶對右下肢各行3個循環(huán)的后處理。ELISA法檢測ROSC24h血漿及腦組織Ach含量，western blot法檢測ROSC24h腦組織α7nAChR表達，免疫熒光

11、染色檢測ROSC24h腦組織α7nAChR與NeuN，CD11b及GFAP的共表達。
　　結果：α7nAChR在神經(jīng)元、小膠質細胞及星形膠質細胞均有表達，RIPost增強心肺復蘇后大鼠α7nAChR的表達，同時減少了活化的小膠質細胞標志物 CD11b和星形膠質細胞標志物GFAP表達；RIPost增加血漿及腦組織中Ach表達量。
　　結論：RIPost影響了心肺復蘇后大鼠Ach和α7nAChR表達，抑制了小膠質細胞的活化和星形

12、膠質細胞的增殖，其腦保護作用可能與激活膽堿能抗炎通路有關。
　　實驗三α7nAChR在 RIPost減輕心肺復蘇后腦損傷炎癥反應中的作用
　　目的：研究α7nAChR在RIPost減輕心肺復蘇后腦損傷炎癥反應中的作用，觀察阻斷此受體后對NF-κB和JAK2/STAT3通路的影響。
　　方法：雄性SD大鼠46只，隨機分5組：假手術組（sham, n=6）、模型組（CA, n=10）、遠隔缺血后處理組（RIPost, n=

13、10）、遠隔缺血后處理+甲基牛扁亭堿組（RIPost+MLA, n=10）、甲基牛扁亭堿組（MLA, n=10）。sham組氣管插管及動靜脈置管，CA組窒息8min后復蘇，RIPost組在ROSC后即刻及3h以止血帶對右下肢各行3個循環(huán)的結扎與開放；MLA組在復蘇即刻腹腔注射MLA。ELISA法檢測ROSC24h血清NSE及腦組織炎性因子濃度，western blot法及免疫熒光染色檢測 ROSC24h腦組織NF-κB、pNF-κB、S