深海細(xì)菌Geobacillus stearothermophilus TH10中嗜熱脂肪酶的表達(dá)鑒定及體外誘變研究.pdf

1、高溫酶因理論研究和工業(yè)應(yīng)用上的雙重意義受到越來越廣泛的關(guān)注。研究高溫酶的適應(yīng)機(jī)制不僅有助于解釋生命起源問題，而且對(duì)于工業(yè)用酶的開發(fā)有理論指導(dǎo)作用。 深海熱液口作為極端環(huán)境的一種，具有高溫高壓高還原物質(zhì)等特征，這也意味著其中蘊(yùn)含著豐富獨(dú)特的微生物資源。它的開發(fā)對(duì)于高溫酶的研究具有重要意義。在生物催化劑的研究和應(yīng)用中，微生物脂肪酶一直占據(jù)著非常重要的地位。高溫脂肪酶因熱穩(wěn)定性好，可以省略一些工業(yè)步驟從而大大節(jié)約制造成本，已廣泛應(yīng)用

2、于食品、化妝品、皮革、飼料、廢物處理等領(lǐng)域。 我們從深海熱液硫化物樣品4143-1分離篩選到一株高產(chǎn)脂肪酶菌株TH10，其最適生長(zhǎng)溫度65℃，16s rRNA鑒定其為Geobacillus。 用Geobacillus脂肪酶保守序列設(shè)計(jì)引物，成功擴(kuò)增得到TH10脂肪酶基因全長(zhǎng)，克隆后于E.coli中重組表達(dá)，性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示其為高溫酶，最適酶活為80℃，即使在90℃仍然保持70％以上的活性。TH10脂肪酶偏堿性，在PH

3、8.0-9.0都有較高活性。在耐受金屬離子方面，該酶并沒有較大的優(yōu)勢(shì)，所有的金屬離子都不同程度的對(duì)酶活性起抑制作用。而在去污劑和酶抑制劑存在的條件下，TH10表現(xiàn)極大的耐受性，tween20和chaps對(duì)酶活性都有一定的提高作用。 Geobacillus TH10脂肪酶的三維模擬結(jié)構(gòu)顯示，它具有脂肪酶共同的α/β三層結(jié)構(gòu)，另外，存在一個(gè)由2個(gè)片狀結(jié)構(gòu)和2個(gè)α螺旋組成的特殊結(jié)構(gòu)區(qū)，是Geobacillus脂肪酶較保守的區(qū)域。溫

4、度較低時(shí)，該結(jié)構(gòu)區(qū)覆蓋在催化區(qū)起保護(hù)作用。 TH10脂肪酶在用PNP底物檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)僅對(duì)降解短鏈脂肪酸鏈有優(yōu)勢(shì)，以C2和C4為最適。通過和同源性最近的Staphylococcus比對(duì)，構(gòu)建了三個(gè)突變子，Q142M，I347V，Q142M/I347V，通過對(duì)突變蛋白與野生型蛋白性質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)其對(duì)底物PNP-C2的活性增強(qiáng)，突變子D47V和Q142M/I347V的熱穩(wěn)定性有不同程度的提高。 目前，關(guān)于Geobacillus

5、脂肪酶的結(jié)構(gòu)研究還不多，而定點(diǎn)突變技術(shù)需要建立在對(duì)目的蛋白的清楚認(rèn)識(shí)和理性分析基礎(chǔ)上。另外，定點(diǎn)突變改變的氨基酸數(shù)量有限，而蛋白任一性質(zhì)都取決于多個(gè)氨基酸的相互作用。我們也嘗試用易錯(cuò)PCR對(duì)TH10脂肪酶進(jìn)行體外定向進(jìn)化。初步結(jié)果表明，5mM的MgCl2可以控制易錯(cuò)PCR的錯(cuò)配率在合適的范圍，從降解PNP-C10的能力來看，文庫(kù)可能包含有益突變。這一結(jié)果有待驗(yàn)證，相關(guān)的工作還在進(jìn)行中。 我們從深海熱液硫化物樣品篩選到高產(chǎn)脂肪酶

6、菌株Geobacillus TH10。對(duì)其脂肪酶進(jìn)行克隆表達(dá)，測(cè)定了系列酶學(xué)性質(zhì)。Geobacillus TH10脂肪酶相比其他已報(bào)道的Geobacillus屬來源的脂肪酶有更高的熱穩(wěn)定性，是進(jìn)一步研究嗜熱脂肪酶的高溫適應(yīng)機(jī)制和穩(wěn)定性較好的材料。利用定點(diǎn)突變技術(shù)研究了在該嗜熱脂肪酶底物特異性和熱穩(wěn)定性方面起關(guān)鍵作用的氨基酸，并試圖通過定向進(jìn)化的方法找到能在降解長(zhǎng)鏈脂肪酸方面有優(yōu)勢(shì)的突變子。已有的研究將為后期酶學(xué)性質(zhì)完善提供理論指導(dǎo)依據(jù)。