疏綿狀嗜熱絲胞菌脂肪酶基因lgy的表達及分子改造.pdf

1、脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)，全稱三酰甘油?；饷福瑥V泛存在于生物體內(nèi)。脂肪酶底物是甘油酯類，水解位點是甘油和12個碳原子以上不溶性長鏈脂肪酸所形成的酯鍵，能夠分解生物產(chǎn)生的各類天然油和脂肪。作為一種界面酶，脂肪酶的水解反應只發(fā)生在油-水界面上，即水溶性的酶在水不溶的底物和水的界面上催化反應。微生物來源的脂肪酶由于作用多樣、易于培養(yǎng)、產(chǎn)量豐富等特點而被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，其中熱穩(wěn)定脂肪酶的研究和開發(fā)更是具有重要的商業(yè)價值

2、。
　　 本實驗室一直從事嗜熱真菌產(chǎn)酶的研究，分離到了疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)，它分布廣泛，生長上限較高，產(chǎn)生的脂肪酶具有較高的工業(yè)價值。本實驗的研究對象是實驗室之前克隆得到的疏綿狀嗜熱絲孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶基因lgy(GenBank登錄號為EU370914)，將其和酵母表達載體pPIC9K雙酶切后用T4連接酶進行體外連接，構(gòu)建酵母重組表達載體pPIC9K/lgy，測序

3、以保證正確的閱讀框。將重組表達質(zhì)粒pPIC9K/lgy用Sac I（位于5'AOX1區(qū)內(nèi)）線性化后轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母，經(jīng)過PCR檢測及G418抗性篩選多拷貝整合子得到工程菌GS-LGY-1，進行甲醇誘導培養(yǎng)，純化蛋白并測定酶活。甲醇誘導6d后酶活性達到最高7.453U/mg。
　　 利用定向進化的方法對疏綿狀嗜熱絲孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶LGY進行分子改造。采用易錯PCR方法，建立了含有14755個轉(zhuǎn)化子的突變體

4、庫。以高活力為篩選壓力，通過三丁酸甘油醑平板透明圈法、G418平板、小量發(fā)酵篩選和大量發(fā)酵測酶活，最后確定一株正向突變菌株MLGY18-126，對此工程菌進行發(fā)酵，通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等步驟純化了突變蛋白并測定酶活，結(jié)果其酶活是野生菌株所產(chǎn)酶活力的2.3倍。對此突變基因進行測得的序列，并與野生基因比較，有3個堿基位點發(fā)生變化，其中兩個位點引起氨基酸的變化，它們是G96V，A192V。
　　

5、 以酵母工程菌株GS-LGY-1為出發(fā)菌，對定向進化突變體中引起氨基酸突變的兩個突變堿基位點進行定點突變，構(gòu)建表達載體后轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，得到兩個定點突變工程菌G96VLGY、A192VLGY。分別進行蛋白表達并測定酶活，結(jié)果定點突變工程菌G96VLGY所產(chǎn)酶活力和定向進化工程菌MLGY18-126基本相同，都比野生工程菌GS-LGY-1高，而定點突變工程菌A192VLGY所產(chǎn)酶活力同野生菌GS-LGY-1基本相同，可以初步認為定