激動(dòng)GPER-1受體對(duì)全腦缺血大鼠CA1區(qū)血腦屏障的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：缺血性腦卒中是全球死亡率的第二大原因。系統(tǒng)研究腦缺血的治療和機(jī)制需要一個(gè)穩(wěn)定的、可復(fù)制性高的全腦缺血模型。盡管在許多研究模型中使用小鼠和沙鼠，但是可靠的全腦缺血大鼠模型也是實(shí)驗(yàn)所需要的，并且有待進(jìn)一步改善。四血管阻斷法是一種廣泛使用的全腦缺血模型。手術(shù)需要灼燒大鼠寰椎的翼狀孔，永久性阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈。但是，術(shù)者往往無(wú)法直視下電凝椎動(dòng)脈使其完全閉塞。因此，建立成功的模型需要依賴觀察大鼠的翻正反射和腦電圖表現(xiàn)。本課題需要建立一種穩(wěn)定的全

2、腦缺血模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打好基礎(chǔ)。
　　血腦屏障是血漿與腦細(xì)胞之間的屏障，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和正常功能的維持至關(guān)重要。血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的功能和形態(tài)與非腦組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞截然不同。在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，血腦屏障的完整性會(huì)遭到破壞，例如缺血性腦卒中。腦缺血對(duì)血腦屏障的損傷作用已被廣泛研究。腦缺血缺氧會(huì)引起腦內(nèi)一系列的分子變化，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接破壞，血腦屏障通透性增加。許多研究證明腦缺血后雌激素可通過(guò)阻止血腦屏障的破壞從而保護(hù)

3、腦組織。雌激素的腦保護(hù)作用是由雌激素受體介導(dǎo)的（ERα、ERβ、GPER-1）。有研究表明ERα和ERβ可介導(dǎo)雌激素對(duì)腦缺血后血管內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白的保護(hù)作用。但是，GPER-1在腦缺血導(dǎo)致的血腦屏障損傷中的作用目前還不清楚。
　　目的：
　　1.探索大鼠椎動(dòng)脈與頸椎的位置關(guān)系，尋找阻斷大鼠椎動(dòng)脈的最佳部位。
　　2.建立穩(wěn)定性高的新型全腦缺血模型，探索最佳缺血時(shí)間和最佳缺血部位。
　　3.探索全腦缺血對(duì)去勢(shì)大鼠海

4、馬CA1區(qū)血腦屏障以及GPER-1和VEGF-A表達(dá)的影響。
　　4.探索激動(dòng)GPER-1受體是否可通過(guò)降低VEGF-A表達(dá)來(lái)保護(hù)全腦缺血大鼠CA1區(qū)血腦屏障。
　　方法：
　　1．采用CTA、DSA、血管乳膠灌注法明確大鼠椎動(dòng)脈走行以及與頸椎的解剖關(guān)系。尋找阻斷大鼠椎動(dòng)脈的最佳部位。
　　2．建立新型全腦缺血模型。根據(jù)全腦缺血10、20、30分鐘后大鼠的存活率，得出大鼠全腦缺血的最佳持續(xù)時(shí)間。隨后進(jìn)行灌注、固定

5、、取腦，采用尼氏染色和TUNEL標(biāo)記染色法觀察腦缺血后大鼠各個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元的死亡情況，評(píng)估新型全腦缺血模型的穩(wěn)定性。最后根據(jù)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分量表和膠帶實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察全腦缺血大鼠的行為學(xué)變化，進(jìn)一步評(píng)估模型對(duì)大鼠行為學(xué)的損害情況。
　　3．采用Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察全腦缺血20min后大鼠CA1區(qū)血腦屏障通透性的變化（IgG漏出率）和連接蛋白（Occludin、Claudin-5）的表達(dá)變化。同時(shí)也對(duì)腦缺血后的CA1區(qū)G

6、PER-1受體和VEGF-A蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行觀察。
　　4．采用Western blot和免疫熒光雙標(biāo)染色觀察激動(dòng)GPER-1受體對(duì)全腦缺血后大鼠CA1區(qū)血腦屏障通透性（IgG漏出率）和連接蛋白（Occludin、Claudin-5）表達(dá)的影響。隨后采用Western blot和免疫組織化學(xué)染色法探索激動(dòng)GPER-1受體是否可通過(guò)降低VEGF-A表達(dá)來(lái)保護(hù)全腦缺血大鼠CA1區(qū)血腦屏障。
　　結(jié)果：
　　1.CTA、D

7、SA、血管乳膠灌注法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在頸1-頸2橫突間隙內(nèi)椎動(dòng)脈位于樞椎上關(guān)節(jié)突的外側(cè)深面，并且不受上關(guān)節(jié)突遮擋，頸后路手術(shù)可以在顯微鏡直視下輕松阻斷椎動(dòng)脈。
　　2.生存分析結(jié)果顯示：10min全腦缺血大鼠術(shù)后7天的生存率達(dá)93％；20min全腦缺血大鼠術(shù)后7天的生存率達(dá)80%；30min全腦缺血大鼠術(shù)后7天的生存率僅為50%。制定20min為新型全腦缺血模型的最佳缺血時(shí)間。
　　3.尼氏染色結(jié)果顯示：20min全腦缺血大鼠CA

8、1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量在術(shù)后第1天無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在術(shù)后第3天出現(xiàn)明顯下降。在隨后的3-7天中，CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量沒(méi)有進(jìn)一步下降。制定CA1區(qū)為新型全腦缺血模型的最佳缺血部位。
　　4.膠帶實(shí)驗(yàn)和TUNEL染色結(jié)果證明全腦缺血大鼠在術(shù)后7天內(nèi)皮層區(qū)和紋狀體區(qū)神經(jīng)元均存在凋亡。新型全腦缺血模型可以導(dǎo)致大鼠運(yùn)動(dòng)整合能力相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元損傷，并且這些神經(jīng)元的損傷可以通過(guò)膠帶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察評(píng)價(jià)。
　　5.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：全

9、腦缺血大鼠CA1區(qū)Occludin和Claudin-5蛋白含量在缺血后6小時(shí)開(kāi)始降低，24小時(shí)明顯降低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以采用全腦缺血后24小時(shí)為觀察時(shí)間點(diǎn)。
　　6.Western blot和免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示：激動(dòng)GPER-1受體可以阻止缺血后OVX大鼠CA1區(qū)連接蛋白表達(dá)（Occludin和Claudin-5）的下降。另外還發(fā)現(xiàn)給予G-1激動(dòng)劑后全腦缺血OVX大鼠CA1區(qū)VEGF-A表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論：
　

10、　1．新型全腦缺血模型可以穩(wěn)定的造成大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，并引起大鼠神經(jīng)功能出現(xiàn)異常。20min的全腦缺血為最佳缺血時(shí)間，CA1區(qū)為最佳缺血部位。
　　2．新型全腦缺血模型可以導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)血腦屏障的破壞，并且在缺血后24小時(shí)，CA1區(qū)血腦屏障破壞最為明顯。
　　3．激動(dòng)GPER-1受體可在腦缺血早期起到穩(wěn)定血腦屏障通透性的作用。激動(dòng)GPER-1受體可以通過(guò)減少VEGF-A的表達(dá)來(lái)穩(wěn)定缺血CA1區(qū)血腦屏障的