消退素D1對大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障的影響.pdf

1、背景
　　腦血管疾病因為較高的發(fā)病率和致殘致死率給社會、家庭及個人造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)，影響人們的生活質(zhì)量，嚴(yán)重危害到人類的生命和健康[1]。因此，尋找有效地治療、預(yù)防腦血管疾病和最大程度地降低缺血性腦損傷的藥物及方法成為醫(yī)學(xué)研究的重點方向。
　　而目前針對缺血性的腦血管疾病尚無有效的治療方法。臨床上采用早期的溶栓治療，同時會引起更為嚴(yán)重的腦缺血再灌注損傷[2]。研究發(fā)現(xiàn)，部分患者的血管在腦缺血后能夠經(jīng)溶栓治療后恢

2、復(fù)再通或自然再通，但是在恢復(fù)血供后，可導(dǎo)致恢復(fù)血流供應(yīng)的腦組織在某一些情況下產(chǎn)生損傷和神經(jīng)功能障礙加重，即腦缺血再灌注損傷[3]。其中研究證實血腦屏障通透性發(fā)生改變可導(dǎo)致腦組織出血和水腫等繼發(fā)性損傷。相關(guān)的研究表明:血腦屏障完整性在腦缺血再灌注損傷的過程中的有重要的作用[4]。
　　血腦屏障由血-腦及血-腦脊液屏障組成，是腦毛細血管特有的特征性結(jié)構(gòu)，維持機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)的改變對神經(jīng)系統(tǒng)有重要的影響。在正常情況下，

3、血腦屏障可以有效的保護腦組織免受許多化學(xué)物質(zhì)和細菌的侵害。在缺血性腦損傷后，血腦屏障的通透性增加，一些藥物、病毒、中性粒細胞和小吞噬細胞就可以通過血腦屏障[5]。血管基底膜由細胞外基質(zhì)分子組成，對維持血腦屏障的完整性起重要作用，而細胞外基質(zhì)分子是基質(zhì)金屬蛋白酶的主要作用底物。國內(nèi)外研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9可降解細胞外基質(zhì)、破壞血腦屏障[6]。
　　消退素(resolvins，Rvs)是一類由ω-3不飽和脂肪

4、酸包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)衍生來的具有抗炎、促炎癥消退作用的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)[7]。研究表明，DHA靜脈注射或富含DHA、EPA飲食能減輕成年大鼠和新生大鼠低氧/缺血誘發(fā)的神經(jīng)功能損傷[8]。有研究發(fā)現(xiàn)ω-3不飽和脂肪酸可以增加腦缺血后的血管生成，提供長期的腦保護[9]。消退素D1(resolvinD1，RvD1)是由DHA內(nèi)生轉(zhuǎn)化而來。已有許多研究發(fā)現(xiàn)RvD1對肝、腎、肺等器官的缺血再灌注損傷有保護作用[10

5、][11][12]。而目前對腦缺血再灌注損傷的影響，國內(nèi)外均未見報道。
　　本試驗采用大鼠腦缺血再灌注損傷模型。觀察消退素D1對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響，以及血腦屏障的通透性的變化，并探討可能的機制。
　　材料和方法
　　分組
　　選擇清潔級健康SpragueDawley雄性成年大鼠（體重260-280g）100只，用完全隨機數(shù)字表法將其分成五組:1.假手術(shù)組+溶劑組:Sham組(5ul);2.腦缺血再灌

6、注+溶劑組:I/R組(5ul)，3.腦缺血再灌注+RvD1小劑量治療組:RvD1(S)組(小劑量0.03nM，5ul);4.腦缺血再灌注+RvD1中劑量治療組:RvD1(M)組(小劑量0.1nM，5ul);5.腦缺血再灌注+RvD1大劑量治療組:RvD1(L)組(小劑量0.3nM，5ul)。
　　方法
　　1.通過改良線栓法，使大鼠右側(cè)大腦中動脈短暫栓塞，制作局灶性腦缺血再灌注損傷模型（MCAO模型）。使用10％水合氯醛(3

7、50mg/kg)給予大鼠腹腔注射麻醉，從頸總動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈置入線栓，并在2h后將線栓拔出，形成腦缺血再灌注。在腦缺血再灌注24h后，進行大鼠神經(jīng)功能損傷評分;
　　2.氯化三苯四氮唑(TTC)染色法檢測大鼠腦梗死體積的變化;
　　3.干濕比法測定腦組織的含水量;
　　4.通過紫外分光光度計法檢測大鼠腦組織中伊文斯藍(evansblue，EB)的含量，檢測血腦屏障(blood-brain-barrier，BBB)的完整性

8、;
　　5.用WesternBlot法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)的蛋白表達;
　　統(tǒng)計學(xué)分析
　　采用SPSS17.0軟件對本實驗的所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)的處理分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。多組間比較采用one-wayANOVA進行單因素方差分析，組間的兩兩比

9、較采用LSD法進行最小顯著差檢驗。α=0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。
　　結(jié)果
　　1.實驗組所有大鼠均在麻醉后2h清醒。缺血再灌注24h時，Sham組大鼠神經(jīng)功能缺損評分為0，I/R組和RvD1組的大鼠在麻醉清醒后均有不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀。腦缺血再灌注24h，與I/R組(2.13±0.78)相比，RvD1(S)組(1.88±0.73)大鼠神經(jīng)功能缺損評分未明顯降低(P＞0.05)，RvD1(M)組(1.25±0.44)和

10、RvD1(L)組(1.67±0.76)神經(jīng)功能缺損評分降低(P＜0.05);與RvD1(L)相比，RvD1(M)組神經(jīng)功能缺損評分降低(P＜0.05)。
　　2.經(jīng)過氯化三苯四氮唑(TTC)染色，正常腦組織為紅色，梗死腦組織為蒼白色。Sham組腦組織梗死體積為0;與I/R組（31.44±3.39）％相比，RvD1(M)組（15.27±3.25）％和RvD1(L)組（18.73±3.87）％腦梗死體積降低(P＜0.05);與RvD1

11、(L)組比較，RvD1(M)組腦梗死體積降低(P＜0.05)。
　　3.Sham組大鼠腦組織含水量為（76.45±1.03）％，與Sham組比較，I/R組（84.29±0.96）％和RvD1(M)組（78.21±0.87）％、RvD1(L)組(80.73±0.64)腦組織含水量均升高.(P＜0.05);與I/R組比較，RvD1(M)組和RvD1(L)組腦組織含水量降低(P＜0.05)，與RvD1(L)組比較，RvD1(M)組腦水含

12、量降低(P＜0.05)腦水腫程度增強。
　　4.Sham組大鼠腦組織呈乳白色，I/R組的大鼠缺血側(cè)部分腦組織呈藍色，RvD1組與I/R組比較缺血側(cè)腦組織的藍色程度明顯減輕。熒光光度計定量測定大鼠腦組織中的EB含量顯示:Sham組（736±129）ng/g，I/R組（3460±605）ng/g、RvD1(S)組（2949±534）ng/g、RvD1(M)組（1637±463）ng/g、RvD1(L)組（1929±581）ng/g;與

13、I/R組相比，RvD1(M)組、RvD1(L)組腦組織中EB的含量減少(P＜0.05);與RvD1(L)組相比，RvD1(M)組腦組織中EB的含量減少(P＜0.05)。
　　5.Sham組MMP-2和MMP-9蛋白含量較低;I/R組和RvD1組MMP-2和MMP-9蛋白含量均升高(P＜0.05);與I/R組比較，RvD1(M)組、RvD1(L)組MMP-2和MMP-9蛋白含量降低(P＜0.05);與RvD1(L)組比較，RvD1(