一株產(chǎn)macrolactins芽孢桿菌PKS基因簇啟動(dòng)子的研究.pdf

1、Macrolactins是一類新型大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有抗菌、免疫抑制、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。目前野生菌發(fā)酵產(chǎn)macrolactins的產(chǎn)量較低，限制了對(duì)此類化合物的研究與應(yīng)用，因此改造相關(guān)生物合成基因簇以提高macrolactins的產(chǎn)量具有十分重要的意義。
　　本文以實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的一株能產(chǎn)macrolactins的野生菌ZJU-2011為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)序確定其為一株新型的解淀粉芽孢桿菌，

2、將其PKS基因簇中高保守的AT結(jié)構(gòu)域及可能的啟動(dòng)子區(qū)域與參考基因簇進(jìn)行比對(duì)，確定了該基因簇的存在并發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子元件位于第一模塊前1Kb左右的位置。以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因構(gòu)建啟動(dòng)子檢測(cè)載體，與P43啟動(dòng)子比較確定該基因簇原始啟動(dòng)子為弱啟動(dòng)子，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)原始啟動(dòng)子是一個(gè)受葡萄糖調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，最適作用溫度為37℃。
　　以P43啟動(dòng)子為基礎(chǔ)通過(guò)飽和突變構(gòu)建啟動(dòng)子突變文庫(kù)。優(yōu)化確定聚合酶環(huán)形延伸克隆(CPEC)最適的退火溫度為61.

3、6℃，最佳的PCR循環(huán)數(shù)為25個(gè)。以LacZ作為報(bào)告基因通過(guò)CPEC克隆構(gòu)建啟動(dòng)子突變文庫(kù)，以β-半乳糖苷酶的酶活表征啟動(dòng)子的強(qiáng)度，篩選得到11個(gè)正向突變株，其中標(biāo)號(hào)為“7”的突變株β-半乳糖苷酶酶活為P43啟動(dòng)子控制下的167.7％。
　　對(duì)采用同源重組法在ZJU-2011中進(jìn)行基因敲除的可行性進(jìn)行研究。確定解淀粉芽孢桿菌ZJU-2011的最適轉(zhuǎn)化條件為甘氨酸添加量為1％，菌體OD600為0.9左右，質(zhì)粒進(jìn)行去甲基化處理，電場(chǎng)強(qiáng)