人動點蛋白Sgo1的功能及其調(diào)控.pdf

1、在有絲分裂中，染色體的分離通過紡錘體與動點之間的相互作用來調(diào)節(jié)，染色體的正確排列與分離還依賴于染色單體之間的粘連。脊椎動物的Sgol蛋白位于動點上，對于防止有絲分裂染色體的早熟分離起著重要作用。Sgol在中后期轉(zhuǎn)換時由APC/C復(fù)合物介導(dǎo)降解，便于染色體在后期得以分開，因此Sgol與存在于染色體臂和著絲粒上的不同粘連方式有著必然的聯(lián)系。Sgol在體外與微管強結(jié)合，在胞內(nèi)具有調(diào)控動點微管的穩(wěn)定性的作用。最近還發(fā)現(xiàn)Sgol與PP2A磷酸酶相

2、結(jié)合共同保護有絲分裂著絲粒處的粘連。但是，Sgol蛋白的分子基礎(chǔ)及其在有絲分裂中的調(diào)控還是很不清楚。 這里我們的研究揭示了人的Sgol蛋白(hSgol)可以被NEK2A激酶磷酸化，這一磷酸化調(diào)控著hSgol的功能。我們利用生物信息學(xué)和質(zhì)譜學(xué)的方法，找到了hSg01被NEK2A磷酸化的兩個重要位點(Ser14 and Set507)，并通過體外生化實驗結(jié)合質(zhì)譜分析，證明了NEK2A可以在細胞內(nèi)外磷酸化hSgol的這兩位點。通過研

3、究hSgol這兩位點的模擬磷酸化和非磷酸化突變體，我們發(fā)現(xiàn)盡管NEK2A的磷酸化并不影響hSgol的動點定位，但是非磷酸化的寒變體會破壞染色體的凝集及其進程，產(chǎn)生較多的動點．微管的錯誤連接，因此我們認為，NEK2A對hSgol的磷酸化，調(diào)控著動點與微管之間的連接，影響染色體的排列與分離。這一機制的揭示，使姐妹著絲粒的粘連與動點．微管的連接可以通過hSgol有機的聯(lián)系起來。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，NEK2A對hSgol的磷酸化，能夠下調(diào)hSgo

4、l的相互結(jié)合蛋白PP2A磷酸酶的活性，雖然我們還不清楚其中的機制，但是，根據(jù)已有的報道，PP2A活性的下調(diào)有利于有絲分裂后期的發(fā)生。 在這篇研究中，我們還對hSgol的降解機制及其在有絲分裂中的作用也作了一些探索。我們的研究發(fā)現(xiàn)，位于hSgol的C端的D-box在hSgol的降解中起著很關(guān)鍵的作用，突變該位點，會導(dǎo)致有絲分裂暫時阻斷在中期，染色體排列在赤道板上不能分開長達一小時以上，直到hSgol的D-box突變體由于某種未

5、知因素被降解，染色體才得以分開，細胞一分為二，由此可見，hSgol的降解與染色體的分離密切相關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)該D-box突變體還使一些細胞產(chǎn)生較多的滯后染色體，而且這些細胞的染色體在有絲分裂期阻斷一段時間后，在還有滯后染色體存在的情況下依然錯誤的分離；鑒于該D-box同時也是潛在的Aurora B磷酸化位點，因此我們檢測了該D-box突變體上Aurora B的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aurora B在表達該突變體的細胞中，動點上的量大大減少

6、，同時在該D-box突變體的細胞中，CENP-E不再定位于動點，參考Aurora B與CENP-E的功能，我們認為hSgol可以通過D-box對Aurora B和CENP-E的調(diào)控來影響染色體排列與分離，或許hSgol正是通過這個D-box來感知姐妹動點之間張力。最后，我們對hSgol的生化特性作了一些研究。我們發(fā)現(xiàn)hSgol的N端和C端都是其定位于動點所必需的，而且N-C端之間還存在相互作用，我們的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實驗在細