AF1q在神經(jīng)發(fā)育中的功能及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進(jìn)行了論述。
　　第一部分 AF1q的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　目的：
　　研究在阿爾茨海默病中AF1q的表達(dá)是否具有特異性，并明確與神經(jīng)發(fā)育及阿爾茨海默病致病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子REST蛋白對AF1q的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，從而進(jìn)一步認(rèn)識兩者的重要關(guān)系。
　　方法：
　　1.應(yīng)用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)法檢測AD鼠模型B6C3-Tg(APPswe，PSEN1

2、 dE9)及其同窩陰性小鼠中AF1q表達(dá)的差異性。
　　2.研究轉(zhuǎn)錄因子REST對人類AF1q基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
　　2.2啟動子質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　2.3將REST高表達(dá)質(zhì)粒pREST或其空白對照與啟動子質(zhì)粒pAF1 qpromoter或其對照pGL3-Basic應(yīng)用Lipofectamine2000共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，24小時后收集細(xì)胞，Luciferase檢測REST對AF1q啟動子

3、活性的影響。
　　3.AF1q啟動子功能性NRSE位點(diǎn)的確定。
　　3.1結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測。
　　3.2構(gòu)建含有或者不含有預(yù)測NRSE位點(diǎn)的截短AF1q啟動子載體，應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，24小時后Luciferase檢測構(gòu)建的截短載體啟動子活性;并且分別與REST高表達(dá)質(zhì)?；蛘咂鋵φ召|(zhì)粒應(yīng)用Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，Luciferase檢測REST對不同

4、截短啟動子的作用功能，初步找出轉(zhuǎn)錄因子REST對AF1q啟動子的調(diào)控位點(diǎn)。
　　3.3凝膠遷移率試驗(yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)從體內(nèi)體外兩方面驗(yàn)證功能性NRSE位點(diǎn)。
　　4.應(yīng)用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測AF1q與REST在C57BL/6小鼠大腦發(fā)育過程中的表達(dá)情況。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)和Sperman相關(guān)分析對數(shù)據(jù)分別進(jìn)行差異性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、
　　結(jié)果：
　　1.與同齡陰性對照小鼠相比，APPswe/PSEN1dE9雙陽性B6C3-Tg小鼠中AF1qmRNA的表達(dá)量相對較低;提示AF1q水平的降低可能與AD的致病相關(guān)，AF1q可能是參與AD的致病過程的相關(guān)分子。
　　2.REST可以抑制人類AF1q基因的轉(zhuǎn)錄。
　　2.1 REST高表達(dá)后內(nèi)源性AF1q mRNA的表達(dá)量降低，而敲除REST后內(nèi)源性AF1q mRNA表達(dá)量升高;提示轉(zhuǎn)錄因子REST能

6、夠下調(diào)AF1q的轉(zhuǎn)錄。
　　2.2與pGL3-Basic相比，Luciferase檢測示pAF1 qpromotor的熒光素酶活性明顯升高，說明克隆的AF1q啟動子序列具有啟動子活性。
　　2.3與對照組相比，REST能夠抑制AF1q啟動子的活性，說明REST通過抑制AF1q啟動子的活性來下調(diào)AF1q的轉(zhuǎn)錄。
　　3.AF1q基因啟動子功能性NRSE位點(diǎn)的確定。
　　3.1計(jì)算機(jī)Jaspar軟件預(yù)測AF1q啟動子

7、區(qū)域的具有2個結(jié)合位點(diǎn);
　　3.2 Luciferase檢測證實(shí)構(gòu)建的截短啟動子均具有啟動子活性;
　　3.3 EMSA和ChIP均驗(yàn)證功能性NRSE位點(diǎn)位點(diǎn)位于-383～-363bp。
　　4.AF1q與Rest在正常成年小鼠大腦神經(jīng)發(fā)育過程中呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.AFq在AD鼠中的表達(dá)明顯低于正常對照組小鼠。
　　2.REST可以抑制人類AF1q基因的轉(zhuǎn)錄。
　　3.人類AF1q

8、基因啟動子區(qū)-383～-363bp可與REST結(jié)合，發(fā)揮功能性NRSE位點(diǎn)的作用。
　　4.AF1q與Rest在正常小鼠大腦神經(jīng)發(fā)育過程中呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分 AF1q通過TCF7激活Wnt信號通路參與神經(jīng)發(fā)育的過程的研究
　　目的：
　　研究AF1q在神經(jīng)發(fā)育中的功能作用;并揭示AF1q作為Wnt信號通路的新分子，調(diào)控Wnt信號通路的分子機(jī)制;明確AF1q與TCF7之間相互作用，以完善Wnt信號通路。

9、>　　方法：
　　1.研究AF1q在神經(jīng)源性細(xì)胞SH-SY5Y中的功能。
　　1.1質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
　　1.2病毒包裝及細(xì)胞感染。
　　1.3將AF1q表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-AF1q-C3和對照質(zhì)粒應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞中，共聚焦顯微鏡下觀察AF1q在細(xì)胞中的定位。
　　1.4 MTT檢測細(xì)胞的增殖。
　　1.5 EdU檢測細(xì)胞的增殖。
　　1.6流式

10、細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。
　　2.研究AF1q對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的作用。
　　2.1神經(jīng)干細(xì)胞的獲取。
　　2.2病毒感染。
　　2.3測量神經(jīng)干細(xì)胞球大小和數(shù)目。
　　2.4檢測神經(jīng)干細(xì)胞分化能力。
　　3.AF1q作用于Wnt信號通路的分子機(jī)制研究。
　　3.1 TOP-Flash&FOP-Flash熒光素酶活性檢測。
　　3.2免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitatio

11、n，Co-IP)實(shí)驗(yàn)檢測AF1q蛋白與TCF7結(jié)合作用。
　　3.3 Western blot分析AF1q結(jié)合TCF7蛋白后TCF7蛋白的穩(wěn)定性。
　　3.4 TCF7的核轉(zhuǎn)錄。
　　3.5 EdU檢測AF1q通過TCF7發(fā)揮功能。
　　3.6 Co-IP明確AF1q與TCF7的結(jié)合位點(diǎn)。
　　3.7 AF1q的磷酸化與TCF7的作用關(guān)系。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用t檢

12、驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.AF1q促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　1.1RT-PCR結(jié)果顯示與對照組相比，構(gòu)建的pcDNA3.1-AF1q-6myc質(zhì)粒以及pEGFP-AF1q-C3質(zhì)粒，均能夠上調(diào)AF1q的表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察pEGFP-AF1q-C3能夠表達(dá)綠色熒光融合蛋白。
　　1.2RT-PCR結(jié)果顯示與對照組相比，含AF1q表達(dá)載體的慢病毒lenti-AF1q能夠上

13、調(diào)AF1q表達(dá)。
　　1.3共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)AF1q主要定位于細(xì)胞漿中，細(xì)胞核中比較少，而在處于細(xì)胞分裂狀態(tài)的細(xì)胞中AF1q在核膜周圍有顆粒狀匯集，表明AF1q主要在細(xì)胞漿中發(fā)揮作用。
　　1.4 MTT檢測表明，與對照組相比，AF1q高表達(dá)能夠促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖。
　　1.5 EdU檢測表明，與對照組相比，AF1q高表達(dá)能夠促使SH-SY5Y細(xì)胞處于增殖狀態(tài)的增多。
　　1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周

14、期顯示，與對照組相比，AF1q高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞處于S期，G2期且使處于G1期的細(xì)胞比例減少。說明AF1q能夠影響細(xì)胞周期。
　　2.AF1q促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖并抑制其向神經(jīng)元方向分化。
　　2.1細(xì)胞免疫化學(xué)Nestin染色證實(shí)分離獲得的懸浮細(xì)胞球?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞。
　　2.2 RT-PCR證實(shí)AF1q表達(dá)載體的慢病毒lenti-AF1q能夠感染神經(jīng)干細(xì)胞，并上調(diào)AF1q表達(dá)。
　　2.3顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照

15、組相比，AF1q高表達(dá)能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞球變大和增加半徑較大的神經(jīng)干細(xì)胞球的數(shù)目。
　　2.4 RT-PCR檢測證實(shí)與對照組相比，AF1q能夠抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化。
　　3.AF1q通過與TCF7相互作用激活Wnt信號通路。
　　3.1 TOP-Flash&FOP-Flsh熒光素酶活性檢測表明AF1q能夠激活Wnt信號通路。
　　3.2 Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測AF1q蛋白能夠與TCF7相互作用，而與LEF

16、1或β-catenin沒有相互結(jié)合。
　　3.3 Western blot分析顯示，與對照組相比，在AF1q存在的條件下，TCF7蛋白的表達(dá)量增加，而且加入CHX后，TCF7的降解速率明顯減慢。
　　3.4 Western blot分析顯示，與對照組相比，AF1q高表達(dá)后，細(xì)胞核中TCF7的含量明顯增加，說明AF1q能夠促進(jìn)TCF7的核轉(zhuǎn)錄。
　　3.5干擾TCF7蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致AF1q促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果降低，說明A

17、F1q是通過TCF7來間接的促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　3.6 Co-IP明確AF1q與TCF7的結(jié)合位點(diǎn)位于AF1q蛋白上第11-20氨基酸位點(diǎn)。
　　3.7 AF1q11位點(diǎn)的磷酸化是與TCF7結(jié)合并發(fā)揮作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　1.AF1q促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖。
　　2.AF1q促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖并抑制其向神經(jīng)元方向的分化。
　　3.AF1q通過與TCF7相互作用激活Wnt信號通路。