副溶血弧菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)功能及其調(diào)控.pdf

1、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種重要的食源性人獸共患病原菌，廣泛存在于海洋環(huán)境，能夠引起人急性腸胃炎、傷口感染和敗血癥，對動物主要引起水生動物疾病，如海鯛、對蝦、九孔鮑、文蛤等。
　　 耐熱直接溶血毒素(thermostable direct hemolysin，TDH)、耐熱直接溶血相關(guān)毒素(TDH-related hemolysin，TRH)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)1(T3SS1)和Ⅲ型分泌系統(tǒng)2(T

2、3SS2)被認(rèn)為是副溶血弧菌的主要致病因子。對實驗室近年來保存的33株臨床分離株和511株環(huán)境分離株進(jìn)行tdh，trh，vcrD1（T3SS1結(jié)構(gòu)蛋白基因）和vcrD2（T3SS2結(jié)構(gòu)蛋白基因）的PCR檢測發(fā)現(xiàn)它們在臨床分離株中的陽性率分別為100％、9.1％、100％和87.9％，在環(huán)境分離株中的分離率分別為11.2％、19.4％、100％和1.2％。 T3SS1存在于所有副溶血弧菌分離株中，這與報道相一致。tdh和T3SS2在臨床分

3、離株中的陽性率均高于環(huán)境分離株，符合致病因子的一般特征。
　　 Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種分泌系統(tǒng)，廣泛存在于革蘭氏陰性菌變形菌門細(xì)菌中，能夠增強(qiáng)細(xì)菌對外界環(huán)境的適應(yīng)性，介導(dǎo)細(xì)菌對宿主細(xì)胞的致病力。對副溶血弧菌全基因組序列RIMD2210633分析發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌中存在兩套T6SS，分別位于染色體1(T6SS1)和染色體2(T6SS2)上。T6SS1基因簇結(jié)構(gòu)與霍亂弧菌的T6SS同源性較高，其結(jié)構(gòu)蛋白基因icm

4、F1在副溶血弧菌臨床分離株和環(huán)境分離株中的攜帶率分別為90.9％和25.0％，提示T6SS1可能與副溶血弧菌的致病力密切相關(guān);T6SS2與一些海洋細(xì)菌的T6SS具有較高的同源性，其結(jié)構(gòu)蛋白基因icmF2在副溶血弧茵臨床分離株和環(huán)境分離株中均為100％。
　　 為了驗證T6SS1和T6SS2是否具有轉(zhuǎn)位和分泌蛋白的功能，本研究選取副溶血弧菌臨床分離株HZ為親本菌株，構(gòu)建了結(jié)構(gòu)蛋白基因icmF1和icmF2，轉(zhuǎn)位蛋白基因hcp1和h

5、cp2的缺失突變株和回復(fù)突變株，并用Hcp1和Hcp2多克隆抗體檢測親本株和T6SS相關(guān)基因缺失株中Hcp1和Hcp2的表達(dá)和轉(zhuǎn)位情況。缺失icmF2后，Hcp2只能在菌體沉淀中被檢測到，而在培養(yǎng)上清中未能檢出，說明T6SS2在體外培養(yǎng)條件下是一個功能性的分泌系統(tǒng)，介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)位和分泌。而Hcp1在親本株、△icmF1和△hcp1的菌體沉淀和培養(yǎng)上清中均檢測不到;互補(bǔ)表達(dá)的Hcp1能在菌體沉淀中被檢測到，但也不存在于培養(yǎng)上清中;熒光定量P

6、CR檢測親本株中icmF1、icmF2、hcp1和hcp2的基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，icmF1和hcp1的轉(zhuǎn)錄量僅為icmF2和hcp2的十七分之一和十分之一。說明T6SS1在體外是一個非活化的分泌系統(tǒng)，相關(guān)基因處于低表達(dá)和低轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。為了研究T6SS的生物學(xué)功能，本研究首先構(gòu)建了缺失副溶血弧菌主要致病因子TDH，T3SS1和T3SS2相關(guān)基因的三缺失突變株DTTT，并以DTTT菌株為親本，進(jìn)一步缺失icmF1、 icmF2、hcp1或hcp

7、2基因，從細(xì)菌對宿主細(xì)胞的感染生物學(xué)（細(xì)胞粘附、細(xì)胞毒性、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和紅細(xì)胞溶血能力）和細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)性（生長特性，抗酸應(yīng)激和形成生物被膜能力）兩大方面展開副溶血弧菌兩套T6SS的生物學(xué)活性研究。
　　 副溶血弧菌T6SS1和T6SS2均具有細(xì)胞粘附能力。缺失了T6SS1結(jié)構(gòu)蛋白就因icmF1和轉(zhuǎn)位蛋白基因hcp1的細(xì)菌，對Caco-2和HeLa細(xì)胞的粘附能力顯著降低，而缺失了T6SS2結(jié)構(gòu)蛋白基因icmF2和轉(zhuǎn)位蛋白

8、基因hcp2的細(xì)菌只對HeLa細(xì)胞粘附能力降低。T6SS1在體外培養(yǎng)條件下處于低表達(dá)和低轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，但在細(xì)胞粘附試驗中呈現(xiàn)一定的活性，且該活性能被Hcp1抗體阻斷。副溶血弧菌T6SS2具有促細(xì)胞自噬的能力?！鱥cmF2、△hcp2和△vgrG2缺失株與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)4h后，細(xì)胞中LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ的量要顯著低于親本株DTTT，而△icmF1菌株與親本株相比差異不顯著。說明T6SS2可能促進(jìn)RAW264.7發(fā)生自

9、噬。副溶血弧菌感染穩(wěn)定表達(dá)LC3-GFP的RAW264.7細(xì)胞，△icmF2缺失株感染的細(xì)胞中LC3-GFP的熒光斑點(diǎn)要顯著低于親本株DTTT，進(jìn)一步證明了T6SS2促進(jìn)RAW264.7自噬。
　　 T6SS2促進(jìn)RAW264.7自噬的活性可能是通過其轉(zhuǎn)位蛋白和分泌蛋白來實現(xiàn)的。目前T6SS2還未有分泌蛋白發(fā)現(xiàn)，因此我們懷疑T6SS2可能通過轉(zhuǎn)位蛋白Hcp2和VgrG2介導(dǎo)細(xì)菌的自噬。在RAW264.7中真核表達(dá)GFP-Hcp2

10、和GFP-VgrG2蛋白，發(fā)現(xiàn)表達(dá)GFP-VgrG2的細(xì)胞LC3-Ⅱ的量要顯著高于對照組（表達(dá)GFP），而表達(dá)GFP-Hcp2的細(xì)胞與對照組相比無顯著差異。向培養(yǎng)RAW264.7的培養(yǎng)基中添加原核表達(dá)的Hcp2和VgrG2蛋白，也呈現(xiàn)類似結(jié)果:添加VgrG2蛋白后，細(xì)胞LC3-Ⅱ的量要高于對照組，添加Hcp2蛋白則變化不顯著。說明T6SS2對RAW264.7細(xì)胞的自噬作用是通過其轉(zhuǎn)位蛋白VgrG2來實現(xiàn)的。不論是細(xì)胞內(nèi)源性的VgrG2，

11、還是外源添加的VgrG2均能引起細(xì)胞自噬，推測VgrG2引起細(xì)胞自噬可能在其刺穿宿主細(xì)胞膜并進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中，引起自噬途徑相關(guān)信號的改變。
　　 無論是T6SS1還是T6SS2，都不具有細(xì)胞毒性和溶血活性，不誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。T6SS1和T6SS2也不貢獻(xiàn)副溶血弧菌對抗酸應(yīng)激和形成生物被膜的能力。
　　 在T6SS2基因簇的下游，存在兩個二元調(diào)控因子VPA1045和VPA1049，具有反應(yīng)調(diào)節(jié)因子典型的Che-Y結(jié)構(gòu)