RNAi干擾技術(shù)在生物節(jié)律相關(guān)基因hper1和clock研究中的應(yīng)用.pdf

1、RNA干擾(RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA通過一定的作用機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)特定基因在mRNA水平上的表達(dá)顯著降低。RNA干擾技術(shù)是過去十年里基因組學(xué)方面最引人注目的發(fā)現(xiàn)之一，該技術(shù)是應(yīng)用21nt的短雙鏈RNAs作為一個短干擾RNAs(siRNAs)當(dāng)它介入到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)時有效的抑制RNA的表達(dá)。RNA干擾技術(shù)因其具有高度特異性和顯著的干擾效果，而在研究和應(yīng)用領(lǐng)域受到高度重視。 時間生物學(xué)的研究表明，人類的很多生命活動具有一

2、定的節(jié)律。在各種不同周期的節(jié)律當(dāng)中，近日節(jié)律是最引人注意，被研究最多的。Circadian，是一個最近幾十年才出現(xiàn)的詞。它被用來描述周期大概為24小時的節(jié)律。人類有很多節(jié)律活動的周期接近24小時。 近日節(jié)律(circadian rhythms)由生物鐘(近日節(jié)律鐘)系統(tǒng)產(chǎn)生和調(diào)控。該系統(tǒng)在調(diào)節(jié)生物的生理功能，并使之與外界環(huán)境相適應(yīng)方面起著重要的作用。目前研究證明PER1是近日節(jié)律分子振蕩中的關(guān)鍵性蛋白，主要通過蛋白與蛋白作用的方

3、式發(fā)揮功能。但 PER1通過何種途徑發(fā)揮作用目前還不十分清楚。因此本文構(gòu)建針對 hper1的高效RNA干擾質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究hper1的功能構(gòu)建平臺，并在此基礎(chǔ)上對hper1的功能進(jìn)行初步研究。結(jié)果：RT-PCR鑒定顯示pTER-hper1-Ⅱ干擾質(zhì)粒干擾效率最高，hper1表達(dá)量降低84．9％。Western Blot顯示hPERl表達(dá)受抑制后，P—p44/42 MAPK水平升高。在哺乳動物，節(jié)律基因per1，per2，Bmal1，C

4、lock和cry1已經(jīng)在精子生成過程中被發(fā)現(xiàn)但卻不是以近日節(jié)律的形式存在。值得注意的是Clock基因的表達(dá)僅僅在圓形精子的項體被發(fā)現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)推測Clock基因在雄性動物的生殖能力中可能起到了潛在的作用。因此在本研究中我們利用RNAi技術(shù)干擾clock在小鼠睪丸中的表達(dá)，結(jié)果westernblot顯示在注射clock干擾質(zhì)粒后3天和6天clock表達(dá)量分別下降55％和48％，為進(jìn)一步探討clock對小鼠生殖功能的影響構(gòu)建平臺，并在此基礎(chǔ)