應(yīng)用RNAi文庫篩選HBV復(fù)制相關(guān)基因.pdf

1、目的：應(yīng)用RNAi文庫建立一種篩選HBV復(fù)制相關(guān)基因的方法，篩選參與HBV復(fù)制的基因，為探討HBV復(fù)制的機理，開發(fā)抗乙肝病毒新藥提供新的靶點。 方法：（1）建立并驗證篩選策略：構(gòu)建HBx-siRNA及HBs-siRNA并感染HepG2.2.15細胞，MEIA法檢測細胞上清中HBsAg，HBeAg的表達量，定量RT-PCR檢測細胞上清中HBV DNA及細胞內(nèi)cccDNA的含量，F(xiàn)ACS檢測細胞表面HBsAg的表達水平。（2）基因篩

2、選并驗證：將RNAi文庫感染HepG2.2.15細胞，利用免疫磁珠收集HBsAg表達降低的細胞，提取DNA，PCR擴增siRNA編碼序列，將PCR產(chǎn)物克隆入T-easy，隨機挑選單克隆測序后選取感興趣的基因，合成其相應(yīng)的siRNA轉(zhuǎn)入HepG2.2.15細胞內(nèi)進行驗證。Western blot檢測被抑制基因編碼的蛋白表達水平，MEIA法及定量RT-PCR檢測HBV復(fù)制情況，F(xiàn)ACS檢測細胞表面HBsAg的表達水平。 結(jié)果：（1）

3、HBx-siRNA及HBs-siRNA感染HepG2.2.15細胞后細胞上清中病毒蛋白（HBsAg，HBeAg）及HBV DNA表達量均低于對照組，細胞內(nèi)cccDNA的相對表達量也較對照組下降。FACS結(jié)果提示抑制HBx或HBs的表達均能夠降低HepG2.2.15細胞表面HBsAg的表達量。（2）在隨機挑選的克隆中成功測序20個，其中一個克隆含有DDB1的編碼序列（可能參與HBV復(fù)制），另一個克隆含有KIAA1919的編碼序列，余下18

4、個克隆的序列不能定位于任何基因。構(gòu)建DDB1-siRNA并轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞后Western blot檢測顯示DDB1蛋白被抑制；MEIA法及定量RT-PCR顯示細胞上清中病毒蛋白（HBsAg，HBeAg）及HBVDNA表達量均低于對照組；細胞內(nèi)cccDNA的相對表達量較轉(zhuǎn)染前明顯下降；FACS結(jié)果也顯示抑制DDB1的表達能夠降低HepG2.2.15細胞表面HBsAg的表達量。 結(jié)論：本試驗建立了一種篩選HBV復(fù)制相關(guān)