聯(lián)合應(yīng)用RNAi技術(shù)和基因芯片技術(shù)研究K562細胞中c-myc基因的功能.pdf

1、K562細胞是由Lazzio從一位慢粒急變病人的胸水中培養(yǎng)建株的人紅白血病細胞，惡性程度較高。白血病的發(fā)生是個多因素、多環(huán)節(jié)、多步驟的漸進過程，涉及許多與細胞生長、分化功能相關(guān)的基因變化。當癌細胞受到內(nèi)外環(huán)境改變的影響時，一些癌相關(guān)基因(原癌基因、癌基因、抑癌基因)以及細胞凋亡分化相關(guān)基因會異常表達，從而使腫瘤細胞出現(xiàn)凋亡的特征性變化，如出現(xiàn)核固縮、碎裂、胞漿中有大量空泡、凋亡小體等典型的形態(tài)變化特征。 c-myc原癌基因是MY

2、C基因家族的一員，為“快速早期反應(yīng)”的細胞內(nèi)信使，是雙向調(diào)控基因，有促進細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡的雙重作用。在接受造血生長因子刺激時則促進細胞增殖；在缺乏造血生長因子或受到促細胞凋亡誘導(dǎo)劑作用時，c-myc介導(dǎo)細胞凋亡。c-myc基因表達失調(diào)是細胞凋亡的主要誘因，屬于細胞凋亡調(diào)控基因中的誘導(dǎo)基因。有文獻報道，c-myc基因表達水平的調(diào)節(jié)與白血病細胞的分化增殖有密切關(guān)系。白血病病人c-myc基因表達過高則預(yù)后不良。 RNAi即RNA

3、干擾，是生物界一種古老而且進化上高度保守的現(xiàn)象，是基因轉(zhuǎn)錄后沉默作用(PTGS)的重要機制之一。RNAi主要通過dsRNA被核酸酶切割成21-25nt干擾性小RNA即siRNA,由siRNA介導(dǎo)識別并靶向切割同源性靶mRNA分子而實現(xiàn)。RNAi技術(shù)是近年來發(fā)展起來的特異性高效抑制基因表達的方法，在后基因組時代的基因功能研究中有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究中為了研究c-myc基因的功能，首先應(yīng)用RNAi技術(shù)，在線設(shè)計針對c-myc基因

4、mRNA三個靶位點(715、1357、1574位點)的siRNAs來干擾K562細胞中該基因的表達。通過比較RT-PCR和流式細胞儀檢測結(jié)果，篩選出針對第1574靶位點的siRNAs干擾效果最好。用這對siRNAs轉(zhuǎn)染K562細胞，通過RT-PCR檢測，觀察到c-mycmRNA水平的表達有明顯降低；通過流式細胞儀和MTT、蘇木素-伊紅檢測，觀察到細胞有一定的凋亡發(fā)生。說明在10％胎牛血清培養(yǎng)條件下，通過RNAi技術(shù)有效的抑制c-myc基

5、因的表達，可誘導(dǎo)K562細胞凋亡。為下一步用芯片研究c-myc的功能奠定了基礎(chǔ)。 同時，本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，分別提取轉(zhuǎn)染前后K562細胞的總RNA，將兩組等量的總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA后，應(yīng)用限制性熒光標記技術(shù)進行擴增標記，Cy3/Cy5熒光染料分別標記對照組/處理組cDNA，熒光標記的樣品與已制備的K562表達譜芯片雜交后，掃描、分析兩組熒光信號的強度和比值。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的K562細胞共有455個基因表達呈下調(diào)

6、趨勢，包括細胞生長調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等；有12個基因表達呈上調(diào)趨勢，包括凋亡相關(guān)基因、細胞代謝相關(guān)基因、細胞周期相關(guān)基因等。這些結(jié)果表明c-myc基因誘導(dǎo)細胞凋亡的機制是非常復(fù)雜的，與其促進細胞增殖的途徑是互相交叉、相互重疊的，而不是完全獨立的。 綜上所述，本研究利用RNAi技術(shù)結(jié)合基因芯片高通量、快速、敏感的特點對干擾后的K562細胞基因表達變化進行了初步的研究，為闡明腫瘤細胞凋亡的分子機制提供了有意義的理論基礎(chǔ)，并可為臨