聯(lián)合應(yīng)用RNAi技術(shù)和基因芯片技術(shù)研究K562細(xì)胞中c-myc基因的功能.pdf

1、K562細(xì)胞是由Lazzio從一位慢粒急變病人的胸水中培養(yǎng)建株的人紅白血病細(xì)胞，惡性程度較高。白血病的發(fā)生是個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多步驟的漸進(jìn)過(guò)程，涉及許多與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化功能相關(guān)的基因變化。當(dāng)癌細(xì)胞受到內(nèi)外環(huán)境改變的影響時(shí)，一些癌相關(guān)基因(原癌基因、癌基因、抑癌基因)以及細(xì)胞凋亡分化相關(guān)基因會(huì)異常表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的特征性變化，如出現(xiàn)核固縮、碎裂、胞漿中有大量空泡、凋亡小體等典型的形態(tài)變化特征。 c-myc原癌基因是MY

2、C基因家族的一員，為“快速早期反應(yīng)”的細(xì)胞內(nèi)信使，是雙向調(diào)控基因，有促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重作用。在接受造血生長(zhǎng)因子刺激時(shí)則促進(jìn)細(xì)胞增殖；在缺乏造血生長(zhǎng)因子或受到促細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑作用時(shí)，c-myc介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。c-myc基因表達(dá)失調(diào)是細(xì)胞凋亡的主要誘因，屬于細(xì)胞凋亡調(diào)控基因中的誘導(dǎo)基因。有文獻(xiàn)報(bào)道，c-myc基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)與白血病細(xì)胞的分化增殖有密切關(guān)系。白血病病人c-myc基因表達(dá)過(guò)高則預(yù)后不良。 RNAi即RNA

3、干擾，是生物界一種古老而且進(jìn)化上高度保守的現(xiàn)象，是基因轉(zhuǎn)錄后沉默作用(PTGS)的重要機(jī)制之一。RNAi主要通過(guò)dsRNA被核酸酶切割成21-25nt干擾性小RNA即siRNA,由siRNA介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA分子而實(shí)現(xiàn)。RNAi技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的特異性高效抑制基因表達(dá)的方法，在后基因組時(shí)代的基因功能研究中有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究中為了研究c-myc基因的功能，首先應(yīng)用RNAi技術(shù)，在線設(shè)計(jì)針對(duì)c-myc基因

4、mRNA三個(gè)靶位點(diǎn)(715、1357、1574位點(diǎn))的siRNAs來(lái)干擾K562細(xì)胞中該基因的表達(dá)。通過(guò)比較RT-PCR和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，篩選出針對(duì)第1574靶位點(diǎn)的siRNAs干擾效果最好。用這對(duì)siRNAs轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，觀察到c-mycmRNA水平的表達(dá)有明顯降低；通過(guò)流式細(xì)胞儀和MTT、蘇木素-伊紅檢測(cè)，觀察到細(xì)胞有一定的凋亡發(fā)生。說(shuō)明在10％胎牛血清培養(yǎng)條件下，通過(guò)RNAi技術(shù)有效的抑制c-myc基

5、因的表達(dá)，可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。為下一步用芯片研究c-myc的功能奠定了基礎(chǔ)。 同時(shí)，本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，分別提取轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞的總RNA，將兩組等量的總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA后，應(yīng)用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記，Cy3/Cy5熒光染料分別標(biāo)記對(duì)照組/處理組cDNA，熒光標(biāo)記的樣品與已制備的K562表達(dá)譜芯片雜交后，掃描、分析兩組熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的K562細(xì)胞共有455個(gè)基因表達(dá)呈下調(diào)

6、趨勢(shì)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等；有12個(gè)基因表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，包括凋亡相關(guān)基因、細(xì)胞代謝相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因等。這些結(jié)果表明c-myc基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制是非常復(fù)雜的，與其促進(jìn)細(xì)胞增殖的途徑是互相交叉、相互重疊的，而不是完全獨(dú)立的。 綜上所述，本研究利用RNAi技術(shù)結(jié)合基因芯片高通量、快速、敏感的特點(diǎn)對(duì)干擾后的K562細(xì)胞基因表達(dá)變化進(jìn)行了初步的研究，為闡明腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了有意義的理論基礎(chǔ)，并可為臨