Furin和NPAS4對(duì)阿爾茨海默病的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要神經(jīng)病理學(xué)特征包括細(xì)胞外神經(jīng)炎性斑（senile plagues, SPs，又稱老年斑）、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles, NFTs）以及由此造成的神經(jīng)元和神經(jīng)突觸的缺失。AD的病因及其發(fā)病過(guò)程仍未徹底闡明，但目前已確定Aβ沉積是老年斑的主要成分，而tau蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)。
　　

2、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）已用來(lái)治療AD并進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)。而研究發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)NGF由前體NGF轉(zhuǎn)化而來(lái)的Furin在AD腦中也降低。Furin是一種前體蛋白轉(zhuǎn)化酶，它還催化腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（BDNF）前體和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）的成熟。這表明Furin在AD發(fā)病中的作用可能遠(yuǎn)大于NGF。
　　目的：本研究（1）通過(guò)建立穩(wěn)定表達(dá)Furin的神經(jīng)元細(xì)胞系，分析Furin與細(xì)胞凋亡、內(nèi)

3、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的關(guān)系以及Furin對(duì)Abeta代謝的影響；（2）通過(guò)真核表達(dá)質(zhì)粒NPAS4轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元，分析NPAS4與tau蛋白清除之間的關(guān)系，基本解明Furin和NPAS4在AD病理環(huán)節(jié)中的作用及機(jī)制，為篩選治療AD的靶分子奠定基礎(chǔ)。
　　方法：神經(jīng)元細(xì)胞系SH-SY5Y轉(zhuǎn)染Furin后經(jīng)過(guò)篩選建立穩(wěn)定表達(dá)Furin的細(xì)胞系，然后采用免疫印跡（Western blot，WB）方法檢測(cè)自噬、凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其Abeta代謝相關(guān)

4、分子。通過(guò)真核表達(dá)質(zhì)粒NPAS4轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元，采用免疫熒光（Immunofluorescence，IF）和免疫印跡（Western blot，WB）方法分析自噬相關(guān)分子的變化及其tau蛋白表達(dá)情況，然后用自噬藥物處理細(xì)胞后WB檢測(cè)tau蛋白變化。
　　結(jié)果：（1）Furin過(guò)表達(dá)能誘導(dǎo)自噬、保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。我們還發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定表達(dá)Furin的細(xì)胞中，IRE1α的磷酸化顯著增加，在H2O2和Tunicamyc

5、in存在時(shí)更加明顯。但PERK、ATF6的變化不顯著，提示Furin選擇性激活了IRE1α，但這一現(xiàn)象還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)驗(yàn)證。（2）JNK和ERK是IRE1α的下游分子，IRE1α在ERS時(shí)獨(dú)立促進(jìn)了依賴于JNK的自噬，且這種作用只依賴于IRE1α的激酶活性，而與IRE1α的內(nèi)切酶活性無(wú)關(guān)。結(jié)果提示IRE1α可能是通過(guò)JNK/ERK調(diào)節(jié)自噬的。因此我們推測(cè)Furin促進(jìn)自噬的作用可能與IRE1α-JNK/ERK通路有關(guān)。（3）Furin能影

6、響APP代謝酶類和減少Aβ產(chǎn)生。根據(jù)以上結(jié)果我們推測(cè)：Furin一方面通過(guò)BDNF促進(jìn)神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)和學(xué)習(xí)和記憶，并對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷和凋亡；另一方面Furin通過(guò)IRE1α-自噬途徑，以及通過(guò)影響ADAM10/PS1活性，最終減輕Aβ沉積，從而改善AD的認(rèn)知障礙。（4）NPAS4過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬。CQ處理后LC3-II和p62蛋白水平增加比NPAS4組更明顯，說(shuō)明NPAS4能誘導(dǎo)自噬通量。（5）自噬抑制（3-MA或CQ）或誘導(dǎo)（血清

7、饑餓）后，我們發(fā)現(xiàn)，血清饑餓誘導(dǎo)的自噬降低了內(nèi)源性總的和磷酸化tau蛋白水平，在NPAS4過(guò)表達(dá)時(shí)這一現(xiàn)象更加明顯。3-MA或CQ處理后內(nèi)源性總的和磷酸化tau蛋白均升高，但是NPAS4過(guò)表達(dá)反轉(zhuǎn)了它的提高。這些結(jié)果表明自噬活性提高對(duì)tau蛋白的清除是有益的。（6）我們用MG132抑制UPS后發(fā)現(xiàn)tau清除被抑制，同時(shí)MG132并沒(méi)有影響自噬（LC3-II沒(méi)變），暗示出NPAS4可能通過(guò)一個(gè)未知的UPS機(jī)制清除tau蛋白。（7）NPAS

8、4并沒(méi)有影響使tau磷酸化的激酶。
　　結(jié)論：Furin一方面通過(guò)BDNF促進(jìn)神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)和學(xué)習(xí)和記憶，并對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷和凋亡；另一方面Furin通過(guò)IRE1α-自噬途徑，以及通過(guò)影響ADAM10/PS1活性，最終減輕Aβ沉積，從而改善AD的認(rèn)知障礙。NPAS4過(guò)表達(dá)能誘導(dǎo)自噬并降低內(nèi)源性tau表達(dá)，且這一機(jī)制由自噬介導(dǎo)。Tau蛋白尤其是磷酸化tau蛋白的清除對(duì)于治療AD等tau病具有重要意義。因此本研究的發(fā)現(xiàn)可能對(duì)于神經(jīng)退行