敲低chemerin對3T3-L1成脂分化過程中Wnt-β-catenin信號通路的影響.pdf

1、Chemerin是一種新型的脂肪因子，早期研究表明，其在3T3-L1細胞成脂分化早期具有重要負調(diào)控作用，但是具體作用機制尚不明確。我們的研究采用Lose-of-function的策略，通過RNA干擾技術(shù)在翻譯后水平敲低chemerin的表達，同時干預PPAR-γ以期發(fā)現(xiàn)chemerin與β-catenin信號通路相互作用關(guān)系。
　　實驗采用AdMax^TM重組腺病毒系統(tǒng)將攜帶有chemerin shRNA片段的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶

2、腺病毒基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，通過Cre/LoxP系統(tǒng)重組產(chǎn)生Chemerin shRNA重組腺病毒。進而用重組腺病毒轉(zhuǎn)染前脂肪細胞并誘導3T3-L1細胞成脂分化，并在成脂誘導第3、7和14天抽提細胞總蛋白和總RNA，進而通過Real-time PCR和WB方法檢測Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子以及成脂關(guān)鍵因子的表達情況。為了更加深入地研究chemerin與Wnt/β-catenin信號通路的聯(lián)系，在敲低ch

3、emerin的同時通過羅格列酮激活PPAR-γ的作用，而β-catenin的穩(wěn)定劑LiCl作為Wnt信號通路的干預劑反向研究Wnt信號通路對chemerin表達的影響。
　　在體外實驗的同時，我們選擇C57 BL/6J野生型小鼠作為模型小鼠，腹腔注射羅格列酮和LiCl，取小鼠附睪處白色脂肪組織進行組織形態(tài)學分析及WB檢測，以驗證體外實驗結(jié)果。
　　結(jié)果，重組腺病毒轉(zhuǎn)染率70％水平下（MOI=500），chemerin表達量降

4、低80%（P<0.01），相較于陰性對照組chemerin敲低組成脂率明顯下降，qPCR結(jié)果顯示，相較于對照組成脂關(guān)鍵基因PPAR-γ（P<0.01）、C/EBPα（P<0.01）、C/EBPβ（P<0.05）和adiponectin（P<0.01）在成脂分化的第3、7和14天均有明顯下降，同時Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子β-catenin（P<0.05）無明顯變化，Wnt10b（P<0.01）明顯下降。WB結(jié)果顯示成脂關(guān)

5、鍵基因C/EBPβ（P<0.01）、和PPAR-γ2（P<0.01）均有明顯下降，adiponectin（P<0.05）明顯上升，β-catenin協(xié)同性上升。
　　共干預結(jié)果顯示，敲低chemerin的同時添加羅格列酮能夠在一定程度上恢復chemerin的表達，使PPAR-γ表達下降，而adiponectin表達上升，β-catenin水平也相應下降，同時細胞成脂率也相應回升；LiCl的添加同樣能夠?qū)е耤hemerin蛋白水平的