牛骨骼肌衛(wèi)星細胞成脂誘導中Wnt-β--catenin信號通路相關miRNA的鑒定及分析.pdf

1、分化的骨骼肌衛(wèi)星細胞是一類多能干細胞，它不僅存在于幼年動物，而且存在于成年哺乳動物。之前的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控多能細胞分化，并且對于多能細胞的成脂分化至關重要。MicroRNA是哺乳動物體內(nèi)的一種內(nèi)源性非編碼RNA，并且在動物脂肪形成過程中起著非常重要的作用，然而miRNA在Wnt信號介導下牛骨骼肌衛(wèi)星細胞成脂誘導中的作用卻很少受到關注。
　　1、牛骨骼肌衛(wèi)星細胞原代培養(yǎng)以及鑒定
　　本試驗采

2、取肉牛后腿骨骼肌組織，通過機械分離將細胞剪碎后用膠原酶和胰蛋白酶雙酶法消化為單個細胞后，采用差速貼壁法純化貼壁細胞，從而獲得骨骼肌衛(wèi)星細胞;通過對骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化顯示，細胞在第二天開始有部分肌纖維出現(xiàn)，在第四天時，已有大量肌纖維出現(xiàn)，并且開始融合為粗大的肌管;通過成脂誘導分化顯示在誘導分化12天后，用油紅O染色，可以看到有脂滴形成并被染色，說明其分化性良好;通過免疫熒光技術對骨骼肌衛(wèi)星細胞特異性基因Pax7進行驗證，結(jié)果顯示95％

3、以上細胞呈陽性表達，說明本實驗培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細胞可以用于下一步實驗。
　　2、骨骼肌衛(wèi)星細胞成脂誘導中Wnt/β-catenin信號相關miRNA表達譜研究
　　LiCl激活Wnt/β-catenin信號通路，通過成脂誘導分化，基因芯片技術篩選了成脂分化過程中不同組差異表達的miRNA，并且通過生物信息學技術對這些差異表達的miRNA進行分析，結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，在783個已知的牛miRNA中有29個差異表達(foldchang

4、e＞2)，其中有12個miRNA表達上調(diào)，17個miRNA表達下調(diào);生物信息結(jié)果顯示，有24個miRNA與脂肪代謝、細胞分化，以及免疫系統(tǒng)有關;在315個靶基因中有39個靶基因不同程度的參與了脂肪細胞的形成、代謝以及干細胞的分化和免疫反應。GO分析以及KEGG通路表明，這些差異表達的miRNA通過不同通路和靶基因參與了骨骼肌衛(wèi)星細胞的成脂誘導。綜上所述，我們研究首次在Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控下牛骨骼肌衛(wèi)星細胞成脂誘導中對m