MiR-138與SIRT1之間的相互拮抗關系以及這種關系在血管生成中的作用.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分：建立內皮細胞的衰老模型，并探討 microRNA-138在這一模型中所起的作用
　　目的：通過建立細胞衰老模型來研究內皮細胞在長期培養(yǎng)過程中細胞增殖能力的變化方式以及microRNA-138表達水平的變化方式，并探討microRNA-138在這一過程中作用。
　　方法：人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）連續(xù)4周每周以1:3的方式進行傳代培養(yǎng)，并將1-4周中每一周的細胞命名為P1、P2、P3

2、和 P4。每一代的細胞在固定的時間點（0、24、48和72 h)）檢測細胞的增殖能力。通過RT-PCR實驗檢測每一代細胞microRNA-138的表達量。通過β-半乳糖苷酶染色檢測microRNA-138對內皮細胞衰老程度的影響。通過CFSE實驗以及PI實驗檢測microRNA-138對內細胞增殖能力的影響并研究具體的影響機制。
　　結果：人臍靜脈內皮細胞的增殖能力隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸下降。通過RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)microR

3、NA-138在人臍靜脈內皮細胞內穩(wěn)定表達，其含量隨著內皮細胞培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加，在P1代細胞中的表達量最低而在P4代細胞中的表達量最高。在細胞衰老實驗中可以看到microRNA-138可以顯著促進內皮細胞衰老。MicroRNA-138可以明顯抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖。MicroRNA-138可以將G2/M期的細胞從29％降到11.84%，將G1/G0期的細胞從55.99%上升到75.83%。
　　結論：在長期培養(yǎng)的過程中，

4、內皮細胞逐漸衰老，增殖能力逐漸下降，與此同時，microRNA-138的表達水平逐漸上升。MicroRNA-138可以促進細胞衰老并通過改變細胞周期的方式抑制內皮細胞的增殖。
　　第二部分：通過體內體外成血管功能實驗證實microRNA-138能夠抑制血管內皮細胞的成血管能力
　　目的：之前的研究證實microRNA-138能夠抑制血管內皮細胞的增殖。本研究通過各種體內、體外功能實驗探討microRNA-138對血管內皮細胞

5、成血管功能的影響。
　　方法：通過遷移實驗、成血管實驗、成球實驗研究等體外實驗研究microRNA-138對血管內皮細胞成血管能力的影響。通過基質膠塞實驗以及視網膜成血管實驗等體內實驗研究microRNA-138能否對體內的成血管過程產生影響。
　　結果：在體外實驗中，我們發(fā)現(xiàn)microRNA-138能夠抑制內皮細胞額遷移能力，減少管腔樣結構在基質膠上形成并能夠抑制三維內皮細胞球的芽生能力。在基質膠塞實驗中，我們看到micr

6、oRNA-138能夠抑制能夠拮抗VEGF的誘導成血管作用。在視網膜成血管實驗中，microRNA-138能夠抑制新生小鼠的視網膜內出生后的血管生成。結論：在體內和體外的成管功能實驗中，microRNA-138能夠抑制內皮細胞的血管生成能力。
　　結論：在體內和體外的成管功能實驗中，microRNA-138能夠抑制內皮細胞的血管生成能力。
　　第三部分：探討microRNA-138抑制血管內皮細胞成血管能力的內在機制
　

7、　目的：之前的研究證實，microRNA-138能夠抑制內皮細胞的血管生成能力，但具體的機制并不明了，本部分研究探討microRNA-138調控血管生成的具體機制。
　　方法：通過生物信息學算法尋找microRNA-138的下游靶基因，通過雙熒光素酶實驗探討microRNA-138對下游靶基因的調控方式，通過WB實驗以及PCR實驗檢測在內皮細胞中microRNA-138是否能對靶基因進行調控。通過回復實驗驗證microRNA-13

8、8調控血管生成的過程是通過下游靶基因完成的。
　　結果：SIRT1是microRNA-138的下游靶基因，該基因的mRNA3’UTR區(qū)與microRNA-138互補配對，雙熒光素酶實驗證實microRNA-138可以通過SIRT1 mRNA3’UTR調控SIRT1的表達。在內皮細胞中，過表達microRNA-138能夠下調SIRT1 mRNA水平以及蛋白水平。過表達SIRT1能夠逆轉microRNA-138對內皮細胞成血管能力的抑