mir-138通過(guò)調(diào)節(jié)MLK3-JNK-C-jun在慢性缺氧心肌凋亡中的作用研究.pdf

1、研究背景
　　復(fù)雜型先心病大部分為紫紺型先心病，是嬰幼兒最常見(jiàn)的先天性畸形，主要由心臟任何水平的右向左分流引起的，慢性缺氧是其共同的病理生理過(guò)程。長(zhǎng)期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，雖然紫紺型先心病患者的心臟被低氧血液長(zhǎng)期灌注，但是仍可以抵御心臟外科手術(shù)所致的缺血缺氧，且很少發(fā)生心力衰竭，提示慢性缺氧可誘導(dǎo)心臟產(chǎn)生代償性的適應(yīng)，而這種變化將會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。因此，深入探討心肌細(xì)胞在慢性缺氧條件下的代償機(jī)制，將有助于改進(jìn)心肌保護(hù)策略，提高先

2、心病的臨床診治水平。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一種進(jìn)化上高度保守的短鏈非編碼RNA，可誘導(dǎo)靶基因mRNA降解以及翻譯抑制，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控蛋白表達(dá)的功能。在心肌細(xì)胞中，多種miRNAs被報(bào)道參與了心肌病理生理過(guò)程，并且與慢性缺氧保護(hù)密切相關(guān)。miRNA-138(miR-138)是最近研究的較為熱門(mén)的miRNA之一。在心臟發(fā)育中，miR-138起到了關(guān)鍵性調(diào)控作用。一旦miR-138表達(dá)降低，將會(huì)出現(xiàn)不同程度的心室肌形態(tài)

3、異常以及心臟功能受損。同時(shí)，miR-138還被發(fā)現(xiàn)與缺氧相關(guān)。缺氧可誘導(dǎo)miR-138表達(dá)上調(diào)，而這種改變能夠促進(jìn)缺氧細(xì)胞的增殖，提示miR-138可能在缺氧條件下發(fā)揮著一種代償性的保護(hù)作用，而其分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
　　C-jun氨基末端激酶(c-jun N terminal kinase，JNK)信號(hào)通路是絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)中關(guān)鍵的通路之一，在

4、心肌細(xì)胞的凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要的作用?；旌献V系激酶3(Mixed Lineage Kinase3，MLK3)是JNK的上游激酶，其能夠誘導(dǎo)JNK磷酸化，而激活后的JNK可以與c-jun氨基末端區(qū)域相互結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子活性，從而促進(jìn)凋亡相關(guān)基因表達(dá)以及蛋白合成。MLK3/JNK/c-jun信號(hào)通路在慢性缺氧心肌中的作用目前還研究較少，因此深入研究其分子機(jī)制及表達(dá)調(diào)控將會(huì)為臨床心肌保護(hù)提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　研究目的
　　本項(xiàng)目

5、擬在細(xì)胞水平及臨床心肌標(biāo)本中檢測(cè)慢性缺氧條件下miR-138及MLK3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和蛋白酶活性;通過(guò)建立體外慢性缺氧心肌模型，應(yīng)用agomir及antagomir技術(shù)實(shí)現(xiàn)miR-138的沉默和過(guò)表達(dá)，在細(xì)胞水平檢驗(yàn)miR-138/MLK3/JNK/c-jun信號(hào)通路的調(diào)控作用，雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)MLK3為miR-138的靶基因，評(píng)價(jià)miR-138在慢性缺氧條件下心肌細(xì)胞凋亡中的影響;采用shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法沉默MLK3

6、，證實(shí)其通過(guò)干擾JNK/c-jun信號(hào)的激活，參與了心肌慢性缺氧適應(yīng)。
　　研究方法
　　1.慢性缺氧模型的建立，及人心肌標(biāo)本的采集:
　　1.1體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞株，無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜后，置于1.0％ O2、5.0％CO2孵箱中培養(yǎng)12h、24h、48h及72h，建立慢性缺氧細(xì)胞模型;
　　1.2缺氧心室肌標(biāo)本取自于紫紺型先心病病人（如法洛四聯(lián)癥），對(duì)照組取非紫紺型先心病病人（如室間隔缺損合并右室流出道

7、狹窄），于手術(shù)中取得標(biāo)本后迅速置于液氮中保存。
　　2.檢測(cè)miR-138、MLK3的表達(dá):
　　2.1采用qRT-PCR、Western blot技術(shù)檢測(cè)miR-138、MLK3在缺氧細(xì)胞及人心肌標(biāo)本中表達(dá)情況;
　　2.2利用免疫組化技術(shù)定位MLK3的表達(dá)。
　　3.研究miR-138在心肌慢性缺氧中的保護(hù)作用:
　　3.1采用agomir及antagomir轉(zhuǎn)染的方法，以穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)miR-138

8、，RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;
　　3.2用流式細(xì)胞儀、TUNEL、Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白活性等方法，研究miR-138干擾后的H9C2細(xì)胞在慢性缺氧時(shí)的凋亡;顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài);WesternBlot檢測(cè)MLK3蛋白表達(dá)水平的變化;
　　3.3構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因，證實(shí)miR-138直接靶向調(diào)控MLK3;采用Western-bolt方法，在miR-138干擾的心肌中檢測(cè)MLK3、JNK、c-jun等M

9、APK中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及磷酸化。
　　4.研究MLK3在心肌慢性缺氧中的作用:
　　4.1構(gòu)建MLK3的shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞以沉默MLK3，RT-PCR、WesternBlot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;
　　4.2繪制穩(wěn)定沉默MLK3的H9C2細(xì)胞在慢性缺氧時(shí)的生長(zhǎng)曲線;LDH、TUNEL、臺(tái)盼藍(lán)染色等方法檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡及活性;Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá);
　　4.3采用Western

10、-bolt技術(shù)，在MLK3干擾的心肌中檢測(cè)JNK、c-jun等MAPK中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及磷酸化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.術(shù)中提取心肌標(biāo)本后， qRT-PCR結(jié)果顯示紫紺組患者心肌中miR-138的表達(dá)量顯著高于非紫紺組患者。將H9C2心肌細(xì)胞株置于缺氧孵箱中分別培養(yǎng)12h、24h、48h、72h后，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果顯示隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，miR-138的表達(dá)量逐漸增加。
　　2.與對(duì)應(yīng)的NC組進(jìn)行

11、比較顯示，agomir組中miR-138表達(dá)量明顯上調(diào)，而antagomir組則下降。MTT檢測(cè)細(xì)胞在缺氧不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示agomir組細(xì)胞生長(zhǎng)率最高，而antagomir組則最低。LDH檢測(cè)細(xì)胞死亡率，miR-138上調(diào)后可顯著抑制細(xì)胞死亡。利用TUNEL、Hoechst染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺氧心肌的凋亡，結(jié)果顯示與NC組相比，agomir組的凋亡數(shù)量明顯減少，而在antagomir組中，心肌凋亡數(shù)量則是最多的。West

12、ern blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在agomir組中cleaved-caspase3、cleaved-PARP、Bad的表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，Bax的表達(dá)無(wú)明顯差異，但是Bcl-2/Bax的比值仍有顯著性的降低，而下調(diào)miR-138表達(dá)后則結(jié)果相反。
　　3.構(gòu)建MLK33'UTR區(qū)的野生型及突變型質(zhì)粒，與agomir共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞株，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果顯示miR-138轉(zhuǎn)染后可明

13、顯降低熒光強(qiáng)度，提示MLK3為miR-138的靶蛋白。在H9C2細(xì)胞中干擾miR-138后，MLK3的表達(dá)也出現(xiàn)明顯的差異性變化。同時(shí)，miR-138還能夠抑制JNK及c-jun的磷酸化。
　　4.在臨床心肌標(biāo)本中通過(guò)Western blot和免疫組化等方法檢測(cè)MLK3的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示紫紺型患者心肌中MLK3表達(dá)明顯低于非紫紺組。在缺氧的H9C2細(xì)胞中，MLK3的表達(dá)也隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。然而，采用qRT-PCR技術(shù)檢

14、測(cè)MLK3的mRNA表達(dá)，在人心肌標(biāo)本以及缺氧H9C2細(xì)胞中均無(wú)顯著性差異。
　　5.MTT、LDH檢測(cè)及臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示沉默MLK3后能夠明顯促進(jìn)缺氧心肌的生長(zhǎng)。利用TUNEL、Hoechst檢測(cè)缺氧心肌的凋亡，MLK3 shRNA轉(zhuǎn)染組中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著降低。Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示MLK3沉默能夠下調(diào)cleaved-caspase3、cleaved-PARP、Bad、Bax的表達(dá)，上調(diào)B

15、cl-2的表達(dá)。同時(shí)，MLK3還能夠影響其下游蛋白JNK及c-jun的活化。
　　結(jié)論
　　1.紫紺組患者心肌中miR-138表達(dá)較非紫紺組明顯上調(diào)，且在H9C2細(xì)胞中，miR-138的表達(dá)隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高。
　　2.miR-138的上調(diào)可顯著減輕缺氧所致的心肌凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞在缺氧環(huán)境下生長(zhǎng)和存活。
　　3.MLK3為miR-138調(diào)控的靶蛋白，干擾miR-138表達(dá)后，MLK3/JNK/c-jun