脊髓背角P2Y13受體參與糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與中樞痛敏的形成，在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持中起著重要作用。以往文獻(xiàn)報道，外周神經(jīng)損傷后，會造成脊髓水平痛覺敏感化，這其中有表達(dá)于脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的P2Y13受體的參與。但目前我們并不清楚糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生過程是否同樣有脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y13受體的參與。因此，本課題采用大鼠糖尿病神經(jīng)痛模型，從在體和離體兩個方面，綜合應(yīng)用疼痛行為學(xué)測定、分子生物學(xué)檢測、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等方法，觀察：（1）糖尿病大鼠

2、疼痛行為學(xué)表現(xiàn)；（2）糖尿病大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活性與P2Y13受體表達(dá)變化；（3）鞘內(nèi)給予MRS2211（P2Y13受體拮抗劑）是否會對糖尿病大鼠疼痛行為學(xué)表現(xiàn)產(chǎn)生影響；（4）鞘內(nèi)給予MRS2211是否會對糖尿病大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的活性與IL-6表達(dá)造成影響；（5）離體狀態(tài)下，MRS2211是否可以影響 ADP（P2Y受體激動劑）誘導(dǎo)背角小膠質(zhì)細(xì)胞激活與 IL-6的合成與釋放。該實(shí)驗(yàn)為探索糖尿病神經(jīng)性疼痛的機(jī)理研究提供新的思路，

3、有助于為以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)開發(fā)新型的鎮(zhèn)痛藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1．明確脊髓背角P2Y13受體是否參與糖尿病大鼠神經(jīng)性疼痛的發(fā)生與維持。
　　2．明確離體狀態(tài)下，P2Y13受體是否可以影響ADP誘發(fā)的脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞功能
　　變化。
　　方法：
　　1．成年SD大鼠，隨機(jī)分為4組(n=8):對照組（僅鞘內(nèi)給予生理鹽水）、藥物+空白對照組（鞘內(nèi)給予100pmol/L MRS2211）、糖尿

4、病大鼠模型組（Diabetes mellitus,DM組）、MRS2211處理組（糖尿病大鼠+鞘內(nèi)注射100pmol/L MRS2211）。各組大鼠均鞘內(nèi)置管。糖尿病大鼠模型組及MRS2211處理組單次腹腔注射60mg/kg的鏈脲菌素（Streptozocin,STZ），72h后測定血糖值≥16.7mmol/L，即造模成功。隨后各組大鼠在造模2w時分別鞘內(nèi)注射生理鹽水或MRS2211（100pmol/L），每日2次，分別在STZ注射前1

5、d、STZ注射后第2，4，6w測定給藥1h后機(jī)械縮足反射閾值（Mechanical withdrawl threshold, MWT）；采用免疫印跡的方法對2、4、6w時大鼠脊髓背角部位P2Y13受體、Iba-1和IL-6的表達(dá)情況進(jìn)行觀察。同時觀察鞘內(nèi)給予MRS2211是否會對糖尿病大鼠的血糖值、尿糖值、體重及飲水量等產(chǎn)生影響。
　　2.取新生（3d以內(nèi)）SD乳鼠脊髓背角培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞并予以純化，熒光定量 PCR（RTFQ-PC

6、R）技術(shù)觀察檢測P2Y13受體拮抗劑MRS2211（10μmol/L）作用前后， ADP（10μmol/L）刺激小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1 mRNA和IL-6 mRNA表達(dá)變化。ELISA技術(shù)檢測MRS2211（10μmol/L）作用前后，ADP刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-6水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.與control組相比，DM組大鼠空腹血糖水平在腹腔注射STZ2w、4w、6w后明顯上調(diào)（P＜0.01），差異具有統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)意義；與control組（正常大鼠尿液中不含葡萄糖）相比，在DM組注射STZ后2w、4w、6w大鼠尿糖水平明顯上調(diào)（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與control相比，DM組大鼠腹腔注射STZ后2w、4w、6w體重明顯下降（P＜0.01）、飲水量明顯增加（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與DM組4w、6w相比較，MRS2211干預(yù)組在STZ注射4w和6w血糖、尿糖、體重、飲水量并沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明MRS

8、2211對糖尿病大鼠的空腹血糖值、尿糖值、體重和24h飲水量沒有產(chǎn)生顯著的影響。
　　2.與control組相比，DM組MWT明顯降低（P＜0.01），第2、4、6w末背角P2Y13受體、Iba-1和IL-6表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01）。與DM組4w,6w相比，MRS2211（100pmol/L）處理組脊髓背角P2Y13受體表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）。與DM組4w相比，MRS2211（100pmol/L）處理組MWT明顯提高（

9、P＜0.01），脊髓背角Iba-1和IL-6表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）；與DM組6w相比，MRS2211（100pmol/L）處理組 MWT沒有明顯變化，脊髓背角 Iba-1和 IL-6表達(dá)也沒有明顯變化。這說明MRS2211濃度為100pmol/L即可在神經(jīng)痛早期發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。
　　3．熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，MRS2211可以部分阻斷ADP誘發(fā)的脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），這說明此效應(yīng)部分

10、由P2Y13受體所介導(dǎo)；MRS2211可以完全阻斷ADP誘發(fā)的脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），這說明此效應(yīng)主要由 P2Y13受體所介導(dǎo)；ELISA實(shí)驗(yàn)觀察到 ADP可以明顯促進(jìn)背角小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6釋放（P＜0.01），MRS2211可以部分阻斷此效應(yīng)（P＜0.05），這說明此效應(yīng)部分由P2Y13受體介導(dǎo)。
　　結(jié)論：
　　1．鞘內(nèi)給予MRS2211（P2Y13受體特異性拮抗劑）對糖尿病大鼠早期