蓮藕中抗氧化成分的抗HIV-1活性及其作用機(jī)制研究.pdf

1、天然產(chǎn)物一直是藥物和藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。已有研究表明,抗氧化、抗HIV-1和免疫調(diào)節(jié)三者之間存在著密切的關(guān)系。本研究首先以抗氧化為篩選指標(biāo),以人們?nèi)粘Ｊ秤玫纳徟簽檠芯繉?duì)象,用大孔樹(shù)脂NKA從蓮藕粗提物L(fēng)中分離到三個(gè)組分L1、L2和L3,活性產(chǎn)物在L2中富集。進(jìn)一步采用葡聚糖凝膠LH-20從L2中分離到7個(gè)組分,分別命名為L(zhǎng)2a～L2g,其中L2c和L2f顯示出較高的抗氧化活性。經(jīng)高效液相色譜從L2c中純化出單一組分L2c-3,從L

2、2f中純化出單一組分L2f-2和L2f-3。通過(guò)質(zhì)譜、紅外光譜、核磁共振等方法確定L2c-3為色氨酸(tryptophan)、L2f-2為沒(méi)食子兒茶素[(+/-)-gallocatechin]、L2f-3為兒茶素[(-)-catechin]。反應(yīng)濃度為250μg/ml時(shí),L2c-3、L2f-2和L2f-3對(duì)紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率達(dá)75.39％、80.26％和79.09％。L2f-2和L2f-3在此濃度下,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化率達(dá)75.42％和

3、74.48％,顯示出極強(qiáng)的抗氧化活性。此外,L2f-2和L2f-3對(duì)超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除活性(IC50分別為126.2μM和204.8μM),同時(shí)它們還可以有效清除羥基自由基(其IC50分別為102.0μM和234.4μM)。采用50％(v/v)和67％(v/v)的乙醇對(duì)蓮藕粗品進(jìn)行分步沉淀,得到兩個(gè)組分LA和LB,其中LB的抗氧化活性遠(yuǎn)高于LA。用葡聚糖凝膠Sephadex G75從LB中分離到兩個(gè)單峰LB1和LB2,其中LB2為

4、活性成分。用凝膠層析確定LB2的分子量約為18.8 kD。經(jīng)化學(xué)分析,LB2糖含量為40.7％、蛋白含量33.4％,由此推測(cè)為多糖蛋白復(fù)合物。通過(guò)多糖水解和單糖PMP衍生的方法測(cè)定LB2中的多糖部分是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖,按摩爾比2:8:7:8:1組成。紅外光譜分析表明LB2是一種同時(shí)具有α-和β-吡喃型單糖以及α-呋喃型單糖的硫酸酯多糖。生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LB2的抗氧化活性比粗品提高了3倍,其對(duì)紅細(xì)胞氧化溶血的抑

5、制率為72.2％(125μg/ml),對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率為83.2％(250μg/ml)。
　　 HIV-1整合酶(IN)是逆轉(zhuǎn)錄病毒特有的酶,在人體內(nèi)沒(méi)有同源類(lèi)似物,是抗HIV-1藥物研究的重要靶點(diǎn),但目前被FDA批準(zhǔn)上市的32種抗HIV-1藥物中僅有一種是IN抑制劑。IN抑制劑研究緩慢的重要因?yàn)橹痪褪呛Y選模型的缺乏。本研究通過(guò)創(chuàng)新性設(shè)計(jì),構(gòu)建了以HIV-1 IN3’切割活性為靶點(diǎn)的新型IN抑制劑體外篩選模型和胞內(nèi)雙質(zhì)粒I

6、N抑制劑篩選模型。在體外篩選模型中,首先通過(guò)雙重PCR技術(shù)在IN中引入兩個(gè)突變位點(diǎn)F185K和C280S,在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)IN的可溶性表達(dá),利用NTA-Ni2+親和柱從菌體裂解液上清中純化帶His標(biāo)簽的IN,用Western Blot檢測(cè)確認(rèn)。重組IN不依賴(lài)其他細(xì)胞蛋白即可對(duì)底物質(zhì)粒pLTR進(jìn)行3’切割使其線性化。通過(guò)DNA電泳,用凝膠成像系統(tǒng)分析不同構(gòu)性質(zhì)粒光密度的變化,計(jì)算樣品對(duì)IN的抑制率。用此模型檢測(cè),蓮藕中大分子LB2抑制IN

7、的IC50為5.28μM,顯示出極強(qiáng)的抗IN作用。同時(shí)蓮藕中小分子L2f-2(IC50:412.45μM)和L2f-3(IC50:432.40μM)也具有比IN抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品Raltegravir(IC50:686.17μM)更強(qiáng)的抗IN活性。在胞內(nèi)雙質(zhì)粒IN抑制劑篩選模型中,通過(guò)利用96孔板-兩步生長(zhǎng)法測(cè)定樣品對(duì)雙質(zhì)粒菌生長(zhǎng)的抑制作用,從而間接顯示抗IN活性。用此模型檢測(cè),LB2在反應(yīng)濃度為10μM時(shí)對(duì)IN的抑制率為47.48％,高于標(biāo)

8、準(zhǔn)品Raltegravir。L2f-3在反應(yīng)濃度為100μM時(shí),也顯示出較高的對(duì)IN的抑制作用,其抑制率為48.78％。用MTT法檢測(cè)樣品毒性發(fā)現(xiàn),在相同反應(yīng)濃度下,Raltergravir處理的正常細(xì)胞存活率不到20％；而L2f-3和LB2處理的細(xì)胞存活率高達(dá)100％,未顯示出任何細(xì)胞毒性。這兩個(gè)模型具有操作簡(jiǎn)單、成本低、檢測(cè)快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),適合大規(guī)模篩選IN抑制劑。
　　 本研究首次證明了蓮藕活性成分的抗HIV-1多效

9、性。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和蛋白酶(PR)也是抗艾滋藥物研究的有效靶點(diǎn)。L2f-2、L2f-3和LB2均可以有效抑制RT活性,其IC50分別為10.41μM、9.58μM和33.70μM。同時(shí),在反應(yīng)濃度為70μg/ml時(shí),L2f-2和L2f-3對(duì)PR的抑制率達(dá)17.61％和15.66％,而市售蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品pepstatin A的抑制率僅為7.36％。細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)作為免疫重建的重要組成部分,在對(duì)HIV-1感染者的治療中起

10、著重要的作用,而細(xì)胞因子是衡量細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。本研究通過(guò)Real-time PCR的方法檢測(cè)蓮藕活性成分對(duì)重要細(xì)胞因子的影響。結(jié)果顯示,L2f-2和L2f-3可顯著上調(diào)Bal b/c小鼠脾細(xì)胞IL-2和IL-6基因表達(dá)水平,同時(shí)下調(diào)IL-10的表達(dá)水平。這種調(diào)節(jié)可提高細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,有利于細(xì)胞抵御病毒感染。L2f-3還可以通過(guò)下調(diào)TNF-α的表達(dá)和抑制Tat對(duì)病毒LTR的激活直接抑制HIV-1的復(fù)制。LB2可以上調(diào)Bal b/

11、c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-2、IL-4和IL-10的表達(dá),從整體上激活免疫系統(tǒng),有利于改善HIV-1感染后細(xì)胞因子普遍降低的狀態(tài),維持機(jī)體免疫平衡。LB2對(duì)TNF-α表達(dá)的下調(diào)作用使其具有可直接抑制HIV-1復(fù)制的能力。
　　 本研究首次構(gòu)建了兩種新型H1V-1 IN抑制劑篩選模型,并從抗氧化、抑制HIV-1關(guān)鍵酶、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)三方面研究了蓮藕中活性成分抗HIV-1作用的機(jī)制。與化學(xué)合成藥物相比,這些天然產(chǎn)物具有更高的抗HIV-1