萌芽綠豆抗敏抗氧化活性物質(zhì)分析及其作用機制研究.pdf

1、本論文基于植物化學(xué)、分析化學(xué)、藥理學(xué)和分子生物學(xué)研究綠豆(Vigna radiatus Linn)萌芽過程中抗敏活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其抗敏作用機理，考察活性成分代謝途徑及外源性植物激素干預(yù)對活性成分代謝的影響。對綠豆SOD和CAT基因進行克隆和序列分析，并初步探討綠豆SOD和CAT的酶活性與基因表達的相關(guān)性。
　　將綠豆萌芽0-168h，每12h取出一組作為樣品進行研究。通過體外透明質(zhì)酸酶抑制實驗和體內(nèi)止癢實驗，確定了抗敏活性較佳的綠豆

2、萌芽時間為48h。通過正交實驗得到的優(yōu)化提取工藝及其數(shù)據(jù)是：80％乙醇回流提取，料液比為1:10，提取溫度為50℃，提取時間為2h。采用不同溶劑對提取物進行萃取，乙酸乙酯層抗敏功效較佳，將該萃取物作為綠豆萌芽抗敏活性有效提取物。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC/MS)技術(shù)定性鑒定出有效提取物中12種酚酸和6種黃酮類成分；通過液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(HPLC-QQQ/MS)技術(shù)定量分析有效提取物，其主要成分及其含量為：異牡荊素45.

3、75mg/g、異槲皮苷193.52μg/g、山奈酚-3-O-蕓香糖苷925.95ng/g、對香豆酸205.89μg/g。利用代謝組學(xué)研究手段，采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)，準確鑒定出綠豆萌芽過程中21種多酚類物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)多酚種類和含量呈現(xiàn)出隨萌芽時間發(fā)生顯著變化的規(guī)律；采用偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)分析不同時期萌芽中主要的差異性物質(zhì)為8種黃酮類成分(牡荊素、異牡荊素、蘆丁、山奈酚-3-O-蕓

4、香糖苷、異槲皮苷、染料木素、大豆苷元、異鼠李素)和2種酚酸類成分(莽草酸、咖啡酸)。采用高效液相色譜(HPLC)方法，對8種黃酮類差異性物質(zhì)進行了定量分析。從酚酸及黃酮類物質(zhì)的變化規(guī)律中，總結(jié)歸納出綠豆萌芽過程中主要抗敏活性物質(zhì)的代謝途徑。
　　采用被動皮膚過敏(PCA)、肥大細胞穩(wěn)定性以及肥大細胞組胺釋放實驗動物模型有效地評價了萌芽綠豆抗敏有效提取物的抗敏活性，模型組與空白對照組比較均有極顯著性差異(p<0.01)。當有效提取物

5、為高、中劑量時，對上述三種模型均有顯著功效；當有效提取物為低劑量時，對肥大細胞穩(wěn)定性以及肥大細胞組胺釋放實驗兩種模型有顯著功效。研究結(jié)果表明：抗敏活性有效提取物通過抑制組胺釋放緩解過敏反應(yīng)導(dǎo)致的瘙癢，通過抑制被動皮膚過敏反應(yīng)及增加肥大細胞穩(wěn)定性，緩解過敏導(dǎo)致的紅腫、泛紅等現(xiàn)象。采用 PMA聯(lián)合鈣離子載體誘導(dǎo)方法建立體外KU812嗜堿性細胞促炎細胞因子高表達模型，結(jié)果顯示，經(jīng)PMA和A23187誘導(dǎo)后，KU812細胞釋放組胺、TNF-α、

6、IL-1β、IL-6、IL-8，使用異槲皮苷干預(yù)后，高、中、低劑量(50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL)的異槲皮苷均可顯著抑制組胺釋放和促炎細胞因子表達，且呈劑量依賴性。說明異槲皮苷可以通過抑制組胺和一系列促炎因子的釋放減輕過敏反應(yīng)中出現(xiàn)的皮膚病理損傷。同時，利用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)實驗研究了異槲皮苷抗敏作用機理，異槲皮苷可顯著降低絲裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)通路細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的表達

7、和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)通路NF-κB的活性。與此同時，采用同樣的實驗和方法，考察了萌芽綠豆有效提取物的抗敏機制，結(jié)果與異槲皮苷一致。異槲皮苷和萌芽綠豆有效提取物抗敏作用均是通過顯著降低MAPKs通路ERK的表達和NF-κB通路NF-κB的活性實現(xiàn)的。
　　通過研究7種植物激素對綠豆萌芽過程中活性成分的影響，篩選出MeJA對綠豆萌芽的影響最大，其較佳的使用濃度為1mmol/L。MeJA外源性干預(yù)可以顯著提高24-72h萌芽總酚含

8、量，進而提高萌芽抗氧化功效。萌芽168h對香豆酸和異牡荊素的含量相比于干預(yù)前分別下降了42.00%和85.85%；山奈酚-3-O-蕓香糖苷、大豆苷元、染料木素、異槲皮苷和咖啡酸的含量相比于干預(yù)前均有不同程度的提高。說明MeJA外源性干預(yù)可以有效提高綠豆萌芽抗敏活性物質(zhì)代謝水平，從而提高萌芽綠豆抗敏相關(guān)活性。
　　采用分子生物學(xué)手段對綠豆的VirSOD和VirCAT進行基因克隆和序列分析，將綠豆SOD和CAT成功克隆所得DNA序列提

9、交GenBank，獲得到注冊號為HQ259252、HQ259253和HQ260597、HQ260598。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知：綠豆的VirSOD和VirCAT分別與其他豆科SODs和CATs聚為一個亞群。采用qRT-PCR的方法測定不同時期萌芽綠豆中VirSOD和VirCAT的表達，二者均在萌芽144h達到最高表達，此趨勢與SOD和CAT酶活性變化規(guī)律吻合，說明萌芽過程中SOD及CAT酶活性增高與VirSOD和VirCAT的表達有關(guān)。